Використання ферментативних реакцій і радіоактивних ізотопів - біоматеріаловеденіе - полімери медичного призначення

Способи аналізів з використанням ферментативних реакцій і радіоактивних ізотопів
На поверхні полімеру, яка має контакт з кров`ю, перш за все адсорбується білок плазми, потім відбувається адгезія тромбоцітов- далі виділяється аденозінфосфат, серотонін та інші активні речовини. Це інтенсифікує когезию і аггрегірованіе тромбоцитів, т. Е. Процес коагуляції крові. Розуміння механізму адгезії тромбоцитів є основоположною проблемою всього розвитку полімерних матеріалів медичного призначення, що володіють тромборезістентностью.
Lee та Kim з співр. [47] здійснили цикл кінетичних експериментів по дослідженню адгезії тромбоцитів до різних полімерним матеріалам- в основі методики лежало використання ферментативних реакцій. Відомо, що при контакті крові з полімером безпосередньо перед стадією адгезії тромбоцитів починається конкуруюча адсорбція складових білка плазми. Для дослідження природи і кінетики цього процесу експериментатори мітили одна тисяча двісті п`ятьдесят один три складові білка: альбумін, у-глобулін і фібриноген. Методика радіоізотопної мітки полягала в тому, що спочатку мітили один з цих білків, а решту залишали немеченнимі- з суміші трьох таких складових готували зразок штучної плазми з співвідношенням альмубін / у-глобулін / фібриноген = = 16/6/3. Потім вводили кожен зразок такого типу в контакт з полімерним матеріалом і кількісно визначали за допомогою сцінціллятора адсорбцію білка в кожному окремому випадку. На рис. 94, 95 і 96 наведені криві, що описують кінетику адсорбції альбуміну, у-глобуліну і фібриногену на зразках сополимера фторетилен з пропиленом, сегментированного терсополімера ефіру з уретаном і сечовиною і на ненаповненому силіконовому каучуку. З графіків видно, що в залежності від природи полімеру швидкість і рівновагу адсорбції зазнають дуже серйозних змін.
Було проведено і такий експериментальний цикл. Зразки, ідентичні описаним, вводили в контакт з кров`ю на 3 хв кожен і визначали склад адсорбованого білка і адгезію тромбоцитів. Отримані результати представлені в табл. 50.

Час, хв
Мал. 95. Конкуруюча адсорбція складових білка плазми крові на поверхні сегментированного сополимера ефіру з уретаном і сечовиною. 1 - фібріноген- 2 - альбумін- 3 - v-глобулін.

Мал. 94. Конкуруюча адсорбція складових білка, плазми крові на поверхні сополимера фторетилен з пропиленом.
1 - фібріноген- 2 - альбумін- 3 - v-глобулін.
Цифровий матеріал показує, що у тих полімерів, які легко адсорбує фібриноген і у-глобулін,

Мал. 96. Конкуруюча адсорбція складових білка плазми крові на поверхні ненаполненного силіконового каучуку.
1 - фібріноген- 2 - альбумін- 3 - y-глобулін.
здатність до адгезії еритроцитів виражена набагато сильніше, ніж у матеріалу, легко адсорбуючого альбумін. Причини такої розбіжності були предметом дослідження Kim з співр. Обрана ними методика заснована на використанні ферментативних процесів.
Відомо, що фібриноген і глобулін - це глюкопротеінов, що містять в бічних ланцюгах вуглеводневі радикали, тоді як альбумін глюкопротеінов не є.

Таблиця 50. Склад білка, адсорбція на поверхні зразків полімерних матеріалів, і число адгезірованних тромбоцитів

З`ясовано також, що на поверхні плівки тромбоцитів існують ціалевокіслотная і галактозна трансферази (ферменти, що транспортують відповідно ціалевую кислоту з її CMP-похідного в графтозние кінці і галактозу з її CDP-похідного в ацетілглюкозаміновие кінці). Все це дало можливість висунути робочу гіпотезу, згідно з якою специфічна зв`язок еритроцитів з білком плазми обумовлена взаємодією глюкотрансферази поверхні еритроцитів з бічними ланцюгами глюкопротеінов плазми - одного з її матриксов [48]. (У розділі 3 вже говорилося про цю гіпотезу.)
З поліетилену і з ненаполненного силіконового каучуку виконували трубки однакового розміру і вводили їх в контакт з розчинами альбуміну (60 мг%), у-глобуліну (60мг%) і фібриногену (20 мг%) кров`яної сироватки бика і з плазмою людини. В результаті внутрішня поверхня трубок покривалася різними білковими відкладеннями. Кожну трубку обробляли нейрамінідазою, отщепляя і видаляючи тим самим від 80 до 90% ціалевокіслотних залишків, що містяться в глюкопротеінов. Крім того, частина трубок піддавали ще й обробці р-галактозидази, видаляючи від 60 до 70% галактозна залишків. Білок, який до обробки ферментами містив на кінцях бічних ланцюгів ціалевокіслотние залишки, перетворювався в матрикс ціалевокіслой трансферази, що підходить для того, щоб шляхом ферментативної обробки видалити з трубок, оброблених одноразово, ціалевокіслотние залишки. Мабуть, саме в силу цього він акцептував велика кількість ціалевой кислоти з її СМР-похідного.
Аналогічна картина спостерігається і у білка, що містить до ферментативного впливу в кінцевих групах бічних ланцюгів галактозу. Після обробки ферментами трубок другої групи він перетворюється у відповідний матрикс галактозної трансферази і, цілком ймовірно, акцептує багато галактози з її UDP-похідного.
Виходячи з цієї гіпотези, здійснювали подальші експерименти. Обробляли гомозіназой отщепленим еритроцити, отримуючи тим самим глюкотраноферазу, і готували її суміші з міченими зразками СМР-14С-ціалевой кислоти і ОР-14С-галактози. Потім приводили ці суміші в контакт з полімерними трубками, обробленими одноразово або двічі за методикою, описаної вище (у всіх випадках тривалість контакту однакова). Після цього кількісно визначали за допомогою сцинтилятора перенесення меченной 14С глюкози в білок на поверхні трубок. Результати експериментів, проведених при 37 ° С на трубках з поліетилену, показані в табл. 51.
Таблиця 51. Обробка бічних глюкози ланцюгів адсорбованого білка і зміна активності трансферази, що переносить ціалевую кислоту і галактозу в еритроцити (трубки з поліетилену, 37 ° С);

Було констатовано наступне. У разі трубок, покритих альбуміном, в якому майже немає бічних ланцюгів, активність глюкотрансферази по відношенню до тромбоцитів залишається низькою незалежно від того, чи піддавалися трубки ферментативної обробці. З іншого боку, у-глобулін і фібриноген, що містять в бічних ланцюгах вуглеводні залишки, характеризуються (навіть перед ферментативної обробкою) високою активністю глюкотрансферази по відношенню до тромбоцитів. Що ж стосується ціалевокіслой трансферази в період після елімінування ціалевой кислоти решт бічних ланцюгів, а також галактозної трансферази після елімінування ціалевой кислоти і галактози, то активність обох цих ферментів зростає на цілий порядок. Результати даних експериментів однозначно показали, що глюкозні бічні ланцюга фібриногену і y-глобуліну, адсорбовані на полімері, функціонують як акцепторів глюкотрансферази поверхні тромбоцитів. Саме в цьому причина високої адгезійної здатності еритроцитів по відношенню до вказаних глюкопротеінов.
Описується дослідження мало на меті розкрити і витлумачити механізм характеристичної зв`язку між бедки кров`яної плазми і еритроцитами з точки зору матриксной специфічності глюкотрансферази еритроцитів по відношенню до структури цукрів бічних ланцюгів білка плазми. У зв`язку з цим дуже важливо було проводити всі дослідження в м`яких температурних умовах з таким розрахунком, щоб здійснювати структурний обмін бічних ланцюгів білків, ні в якому разі не змінюючи будову основних ланцюгів. Використання ферментативних реакцій дозволило Lee і Kim успішно виконати це завдання. Невирішеним поки залишається питання про причини того, чому фібриноген і глобулін, що знаходяться в адсорбованому стані, активно взаємодіють з тромбоцитами, тоді як ті ж білки, але вільно існуючі в плазмі крові, аж ніяк не проявляють особливої активності.
Таблиця 52. Вплив 1 ~ на адсорбцію 1311-АКС на поверхні платини, хрому та кремнію (мг / м2)

Крім того, експерименти показали, що для кількісного визначення адсорбції білка на поверхні медичних полімерів вельми ефективним виявляється спосіб застосування радіоактивних ізотопів. У літературі описані деякі питання в цій області, залишаються поки невирішеними і потребують розробки [49]. Для мітки білків найбільш часто використовуються ізотопи 1311 і 1251. У табл. 52 показані результати аналізів з визначення адсорбції альбуміну кров`яної сироватки людини (АКС) на поверхні платини, хрому та кремнію. Експерименти були засновані на використанні 1311. Зразки трьох металів попередньо витримували протягом 18 год в розчині йодиду натрію (1 мг / мл).
З матеріалу табл. 52 видно, що на поверхні хрому і кремнію білок у всіх випадках адсорбується в кількостях одного порядку, а на платині - набагато інтенсивніше. Цілком ймовірно, що такий перепад пов`язаний зі здатністю платини селективно адсорбувати йод, внаслідок чого вона дуже сприйнятлива до впливу I- в розчині. Таким чином, цифри в табл. 52 відповідають не тільки адсорбції АКС на поверхні платини, але і седиментації всього обсягу йоду в системі.
Замість мітки 1311 можна використовувати 3Н. Адсорбція мічених 3 Н і 1311 зразків АКС на поверхні платини і хрому показана в табл. 53. Значний перепад рівнів адсорбції, що досягає 95%, дозволяє констатувати наявність специфічних взаємодій білка з матеріалом. Крім того абсолютно не виключені зміни структури білка і внаслідок введення мічених атомів. Так, спостерігається значний перепад у рівнях адсорбції зразків 1311-АКС і 1251-АКСг незважаючи на ідентичність методів приготування мічених зразків і умов експерименту. Всі фактори, що викликають розбіжність, ще не витлумачені, однак можливість структурних змін білка при введенні радіоактивних ізотопів не викликає сумнівів.