Методи пошуку біологічно активних протиепілептичних речовин - фармакологічна регуляція психічних процесів

МЕТОДИ ПОШУКУ біологічно активних речовин, ЯКІ МАЮТЬ Протиепілептична ВЛАСТИВОСТЯМИ
Незважаючи на досить великий арсенал наявних антиконвульсантів, потреба в нових протиепілептичних засобах ще дуже велика в зв`язку з недостатньою ефективністю, частотою токсичних і побічних ефектів наявних препаратів.
Завдання сучасної фармакології і нейрофізіології в області епілепсії можуть бути сформульовані наступним чином:

1. пошук нових, більш ефективних і менш токсичних засобів у порівнянні з наявними лікарськими препаратами;
2. створення препаратів з виборчим дією відносно певного типу пароксизмів, нападоподібний і постійних психопатологічних розладів епілептичного генезу;
3. дослідження молекулярно-біологічних механізмів дії відомих і нових лікарських препаратів і на цій основі розробка науково обґрунтованих методів їх пошуку в експерименті та клініці;
4. вивчення фармакокінетики протиепілептичних засобів, визначення ефективних концентрацій кожного препарату і облік цих даних при визначенні разових і добових доз, тривалості курсів лікування;
5. виявлення відмінностей в ефектах і механізмах протиепілептичної дії різних груп препаратів для визначення місця кожної групи в комплексному лікуванні епілепсії.

Питання експериментального пошуку протиепілептичних препаратів є одним з найбільш розроблених в фармакології.
Це пов`язано з тим, що вже в кінці минулого століття досить успішно розроблялися експериментальні моделі епілепсії. Починаючи з робіт А. Д. Сперанського по електричному подразнення мозку, експериментальна патофизиология, фармакологія накопичували досвід створення моделей епілепсії. З цією метою використовувалися роздратування різних областей мозку електричним струмом, різні хімічні агенти, що викликають судоми при введенні в організм або аплікації на чутливі ділянки мозку. Описано величезна кількість судомних отрут, що діють за різними механізмами на мозок і викликають типові зміни нейронної активності, біоелектричної активності мозку, судомні напади.
Swinyard [+1949], Chen з співавт. [1954] запропонували набори тестів для відбору протисудомних засобів. З тих пір електрошок постійно використовується для створення моделі великих епілептичних припадків і відбору протисудомних препаратів за їхньою здатністю попереджати тоніко-екстензорная фазу Електросудомна припадків. В якості моделі малого епілептичного нападу найчастіше використовується коразолові модель судом, хоча в залежності від дози і способу введення коразол може викликати і порушення, характерні для малого припадку з його електрофізіологічних корелятом пік-хвиля, і зрушення, типові для великих генералізованих судом.
Незважаючи на досить велику історію питання, до сих пір немає єдності у виборі методів пошуку протиепілептичних препаратів, кожна лабораторія застосовує свій набір методів або один метод, а його вибір при цьому зазвичай не обґрунтований. У наявних методичних рекомендаціях [Саратіков, 1977] перераховані методи, які можуть в повній мірі характеризувати на етапі доклінічних експериментальних досліджень препарат з вираженою протисудомну актівностью- питання пошуку, первинного відбору речовин з протиепілептичної активністю в них не обговорюються.
У той же час, з нашої точки зору, надзвичайно важливо розрізняти послідовні етапи дослідження в процесі пошуку нових протисудомних засобів. Необхідно також знайти такі методичні підходи, які дозволили б не тільки виявити нову речовину з протисудомні властивості, а й розділити групи протиепілептичних препаратів за основним механізмом дії. Досягнення нейрофізіології роблять це завдання здійсненною. А це дозволяє в подальшому більш чітко визначити показання для клінічного застосування кожної групи препаратів, виявити її роль в лікуванні тих чи інших епілептичних розладів.
У 1980 р Koela запропонував набір тестів для первинного і поглибленого дослідження антиконвульсантів. На етапі первинних випробувань автори використовують такі судомні агенти для створення моделі епілепсії: максимальний електрошок- коразол, пікротоксін- стрихнін.
На етапі поглиблених випробувань для моделювання малих припадків запропоновано використовувати коразол і електростимуляцію білої речовини сенсомоторних областей мозку, для моделювання психомоторних припадків - електрораздраженіе гіпокампу.
Eadie, Tyrer [1983] рекомендують наступні моделі епілептичних синдромів, адекватні клінічними проявами епілепсії

Проведені дослідження механізмів дії протиепілептичних препаратів, апробація різних методів оцінки протисудомних засобів дають підстави для рекомендацій по методам пошуку цієї групи препаратів.

Етапи вивчення нових біологічно активних засобів

Як уже згадувалося, після надходження нових хімічних з`єднанні вони проходять кілька загальних і приватних етапів дослідження. Для протиепілептичних препаратів це наступний порядок вивчення: 1) реєстрація нового хімічної сполуки;

1.  аналіз його структури і прогноз біологічної активності;
2. первинне вивчення психотропних і протисудомних властивостей;
3.  поглиблене дослідження протиепілептичних властивостей на різних моделях судомного синдрому- 5) виявлення приналежності нового активного з`єднання до певної групи протиепілептичних препаратів за основним механізмом дії-6) наскрізні випробування препарату з метою виявлення їх фармакологічних і побічних еффектов- 7) вивчення безпеки нового потенційного протиепілептичного препарату по програмі, передбаченої вимогами Фармакологічного комітета- 8) дослідження фармакокінетики препарату-9) клінічні випробування потенційного протиепілептичного препарату-10) дослідження тонких механізмів його дії.

Організація та проведення первинних випробувань хімічних сполук на протисудомну активність

Первинне вивчення протисудомної активності речовин має на меті відповісти на наступні питання: 1) чи володіє дана речовина протисудомну актівностью- 2) приблизно визначити ступінь вираженості цієї активності- 3) вирішити, чи доцільно подальше поглиблене або уточнююче дослідження протисудомних властивостей речовини
Первинне вивчення протисудомних властивостей нових хімічних сполук проводиться нами одночасно з виявленням потенційних психотропних властивостей, як описано вище.
Це призводить до необхідності спільне застосування методів виявлення психотропних видів активності і протисудомну активності з таких міркувань. Психотропні та протисудомні властивості речовин близькі і постійно переплітаються в спектрі дії як психотропних, так і протиепілептичних засобів
Як уже підкреслювалося вище, протисудомні властивості є у деяких нейролептиків, антидепресантів, вони постійні у транквілізаторів. У той же час в структурі дії
більшості протисудомних препаратів представлені седативні, транквилизирующие властивості. Тому виявлення в процесі такого комплексного вивчення седативних властивостей у нового речовини є прогностично важливим для дослідження протисудомних його властивостей, і навпаки.
Крім цього, така загальна програма досліджень робить первинне вивчення хімічних речовин більш економним, інформативним, так як дозволяє на одних групах тварин при мінімальних витратах речовини отримати максимальну інформацію про різних типах активності.
При первинному випробуванні ми використовуємо тільки дві моделі судомного синдрому: максимальний електрошок (50 мА, 0,2 с, 50 Гц) і коразолові судоми. Ці два тести, як показує досвід, достатні для виявлення препаратів, здатних пригнічувати різні типи судомних синдромів.
Крім цього, антікоразоловое дія може свідчити про транквилизирующий властивості речовини, вказувати на можливий ГАМКергіческіх механізм дії препарату. Електросудомна припадок розвивається в певній послідовності фаз - клонической, тонической, тоніко-екстензорной. У процесі оцінки дії речовин на дану модель визначаються два показника:
а) кількість тварин в групі, у яких розвинулася тоніко-екстензорная фаза
б) кількість загиблих тварин в групі (порівняння контрольної і дослідної груп).
Ознакою противосудорожного дії речовини є блокада тоніко-екстензорной фази припадку і захист тварин від загибелі.
При використанні коразолові моделі судом коразол вводиться внутрішньочеревно в абсолютній смертельній дозі - 150 мг / кг. При цьому в контрольній групі у всіх тварин відзначаються клонічні судоми, далі через 3-7 хв. настає загибель відразу після розвитку тоніко-екстензорной фази. Оцінюються такі показники: а) тривалість життя тварин в кожній групі-б) наявність тоніко-екстензорной фази- в) наявність клонической фази.
Ознаками противосудорожного дії речовин є продовження життя в дослідній групі в порівнянні з контролем, захист від загибелі (реєструється кількість загиблих і тих, що вижили тварин в групі), відсутність тоніко-екстензорной фази, відсутність або вкорочення клонической фази припадку.
Якщо протисудомний ефект виражений яскраво і беззаперечний (100% захист тварин від тоніко-екстензорной фази в тесті максимального електрошоку і 100% захист від загибелі в тесті з коразолом), можна переходити до етапу поглибленого дослідження.
Якщо результат сумнівний, не настільки яскравий, доцільно провести уточнюючі дослідження.
В останньому випадку ті ж тести повторюються на групах,
включають більшу кількість тварин, доповнюються тестом з внутрішньовенним титруванням коразола, стрихніну і вже після цього виноситься рішення про проведення поглиблених досліджень.

Проведення етапу поглиблених досліджень активних протисудомних речовин

Етап поглибленого дослідження має на меті виявлення наступних сторін дії речовини:

1. ) Кількісне визначення противосудорожного ефекту речовини на різних моделях судомного синдрому;
2.  порівняння даної речовини по кожному ефекту з таким же показником еталонного препарату (як еталонних препаратів зазвичай використовуються фенобарбітал, дифенілгідантоїн, етосуксимід, діазепам);
3.  визначення широти терапевтичної дії нової речовини, а також захисного індексу і порівняння за цими показниками з еталонним препаратом;
4.  винесення рішення про доцільність клінічних випробувань даного препарату, якщо він має певні переваги перед еталонними препаратами;
5.  віднесення до певної групи антиконвульсантов за механізмом противосудорожного ефекту.

У процесі поглибленого дослідження нами використовується досить широкий набір моделей судомного синдрому, що дає можливість врахувати різні механізми розвитку епілептичної активності: 1) тест максимального електрошоку (миші і щури);

1. коразол в дозі 110 мг / кг-3) внутрішньовенне титрування 1% -ного коразола, 0,01% -ного стрихніну, бікукулліна, пікротоксину;
2. гиперкинез, викликаний стимуляторами центральних м-холінергічних (ареколін), н-холінергічних (нікотин), серотонінергічних (5-оксітріптофан) систем мозку-5) створення вогнища судомної готовності шляхом аплікації 50 ОД пеніциліну через вживлену канюлю на сенсомоторную зону кори мозку щури- 6 ) аудіогенних судоми (дзвінок 100 дБ протягом 1,5 хв) у щурів лінії КМ.

У тестах 1, 2, 4, 6 визначаються методом Litchfield, Wilcoxon [+1949] ЕД-50 - середні ефективні дози, що блокують розвиток нападу або тоніко-екстензорной фази припадку у 50% тварин.
У разі внутрішньовенного титрування коразола, стрихніну, бікукулліна визначаються порогові дози судомного отрути, що викликають початок нападу або тоніко-екстензорная фазу нападу.
При створенні пенициллинового епілептичного вогнища визначається кількість нападів за годину, а також специфічних змін ЕЕГ за певний проміжок часу (хвилину) в контролі і через різні проміжки часу після введення випробуваного препарату.
Такий набір тестів дозволяє виявити спектр активності нового речовини, уточнити, на яких моделях воно найбільш ефективно.
Кількісні показники, визначені по кожному тесту для еталонного і випробуваного препаратів дають підставу для судження про цінності даного препарату, його переваги перед еталонним по вираженості основного ефекту, набору властивостей. Далі з цих же показників визначається широта терапевтичної дії (ЛД50 / ЕД50), а також захисний індекс (ТД50 / ЕД50).
ТД50 - токсична дія речовини - визначається за здатністю викликати токсичний побічний ефект, наприклад атаксія, загальне пригнічення у 50% тварин.
Якщо випробуваний препарат по вираженості основних ефектів, спектру активності, широті терапевтичної дії, захисному індексу перевершує відомі еталонні препарати, виноситься рішення про доцільність вивчення його безпеки з метою проведення подальших клінічних випробувань.

Диференційоване вивчення групової приналежності нового противосудорожного речовини за механізмом дії

Описані вище методичні підходи, використання різних моделей судомного синдрому на цілісних тварин дозволяють добре охарактеризувати протиепілептичний ефект, але не диференціюють різні групи препаратів, що мають здатність змінювати епілептичну активність.
У цих тестах, по суті, однаково поводяться і класичні антиконвульсанти типу фенобарбіталу, бензонала, і похідні 1,4-бензодіазапіна і сукцініміди, і похідні вальпроєвої кислоти.
У той же час дія цих препаратів на епілептичний процес неоднозначно.
Виходячи з наших даних про можливість поділу препаратів протиепілептичної дії на три групи по їх відношенню до виникнення і розповсюдження епілептичної активності, запропоновано на етапі поглиблених досліджень проводити спеціальне вивчення на ідентифікованих нейронах молюска Helrt pomatia. Електрофізіологічні досліди з допомогою мікроелектродної техніки [Балабан, 1978] проводяться на пейсмекерних «вспалахо» нейронах вісцерального ганглія молюска, на спонтанно активних мотонейронах букальний гангліїв. Визначається вплив речовин: а) на спонтанну активність нейронів, «спалахову» активність- б) мембранний потенціал- в) на ефект 0,1 в 0,05% -ного розчинів коразола в цих нейронах- г) реакцію на ортодромной стимуляцію.
Як кількісних показників, крім прямого запису активності нейронів на реєструє осциллографе, використовується: а) частота імпульсів в хвилину-б) величина трансмембранного потенціалу. Випробовувані речовини вводяться в перфузійний розчин в різних концентраціях, частіше 1-10-4М-1-10_6М.

Зіставлення даних цих дослідів з результатами експериментів на моделях судомного синдрому па тварин дає основами віднести новий протиепілептичних препарат до однієї з трьох груп:

1.  впливають на ендонейрональную ритміку нейрона, які блокують виникнення епілептичної активності (типу фенобарбіталу);
2.  пригнічують і виникнення, і поширення епілептичної активності (типу дифенілгідантоїну);
3.  блокуючих тільки поширення епілептичної активності (типу бензодіазепінів).

У період «наскрізних» випробувань за участю фахівців різного профілю вивчається дію активної речовини на інші органи і системи, виявляються їх додаткові корисні або небажані, побічні ефекти щодо серцево-судинної, дихальної, ендокринної та інших систем організму.
Дослідження механізмів дії протиепілептичних препаратів повинно спиратися на наявні відомості про молекулярно-біологічні основи розвитку епілептичної активності і ефектів антиконвульсантів. Воно включає вивчення впливу нових препаратів: 1) на біоелектричну активність мозку в нормі і при наявності патологічного процесу-2) асиметрію мозку-3) просторову синхронізацію діяльності різних областей мозку-4) активність різних за функціональними характеристиками нейронів, особливо активність пейсмекерних «вспалахо» нейронов- 5) вольт-амперні характеристики іонних струмів в мембранах збудливих клітин 6) синаптичну передачу- 7) медіаторні системи, особливо взаємини з системою ГАМК 8) біоенергетичні процеси в нервових клітинах-9) інші системи організму, крім нервової.