Застосування ізотопів в гістології - основи гістології

метод авторадиографии

На відміну від гистохимии, яка дозволяє визначати лише локалізацію і концентрацію хімічних речовин в структурі, авторадіографія, крім того, дозволяє вивчати розподіл різних речовин в клітинах, тканинах і органах всього організму, шляхи і механізми їх надходження і виділення з нього і ін. В основі авторадиографии (як світлооптичної, так і електронно-мікроскопічної) лежить процес, аналогічний фотографічному, з тією лише відмінністю, що «засвічує» фактором при авторадиографии є не світло, а іонізуюче випромінювання, що випускається при розпаді ядер радіоактивних атомів, введених в організм у формі тих чи інших з`єднань. Замість же фотографічної пластинки (плівки) використовується спеціальна емульсія, якою покривають гістологічні середовища (а також мазки, відбитки органів і т. Д.) З метою забезпечення найбільш тісного контакту її з досліджуваними структурами. Після експозиції, достатньою для того, щоб кристали броміду срібла (що входять до складу емульсії), що знаходяться в безпосередній близькості від місця локалізації радіоактивного ізотопу, перетворилися в зерна металевого срібла, зрізи виявляють, фарбують, зневоднюють і укладають в бальзам. При мікроскопірованіі автографів місця локалізації радіоактивних атомів виявляються у вигляді чорних зерен. За кількістю зерен можна судити (до деякої міри) про кількість сконцентрованої в даній області радіомітка.
Наводимо використання методу авторадиографии для дослідження процесу біосинтезу ДНК при мітотичного ділення клітин епітелію тонкої кишки у щура.

Відео: Нервова клітина // Научфільм

1. Щура внутрибрюшинно вводять Н-тимідину (один з компонентів молекули ДНК) з розрахунку 1 мк Кі на 1 г маси тіла і забивають через 1-12 год.
2. Фрагмент тонкої кишки фіксують (найчастіше в 10% формаліні або рідини Карнуа), зневоднюють і заливають в парафін.
3. Готують гістоліческіе зрізи товщиною
4. 7 мкм.
5. Депарафініруют в двох-трьох змінах ксилолу (толуолу) по 1-2 хв.
6. Висушені зрізи покривають емульсією при температурі 42 ° С (у фотокімнаті при темно-червоному ліхтарі).
7. Укладають в світлонепроникну коробку і витримують в холодильнику 14-30 діб.
8. Виявляє в амідоловом проявнику.
9. Обполіскують дистильованою водою.
10. Занурюють в «стоп-розчин» (1% розчин оцтової кислоти) на 0,5-1 хв.
11. Фіксують в 30-40% розчині тіосульфату натрію 1 хв.
12. Промивають проточною водою 20-30 хв.
13. Висушують на повітрі.
14. Фарбують гематоксилін-еозином (як завжди).
15. Зневоднюють в спиртах висхідної концентрації.
16. Прояснюють і укладають в бальзам.

метод імунофлюоресценції

Імунофлюоресцентний метод - єдиний в своєму роді морфологічний метод, що дозволяє досліджувати топографію в клітинах і тканинах складних біологічних речовин (ендогенного або екзогенного походження), наділених індивідуально специфічною структурою (білки, полісахариди, нуклеїнові кислоти і ін.). Сутність даного методу зводиться до наступного. Речовиною, ідентичним тому, локалізацію якого в досліджуваному об`єкті (тканини, клітини) хочуть вивчити, імунізують інша тварина і через певний час (достатнє для вироблення антитіл) з його крові отримують антисироватки. Антитіла, що містяться в у-глобулінової фракції антисироватки, хімічним шляхом з`єднують з флюорохромом (особливим з`єднанням, здатним давати яскраве світіння - флюоресценцію - під дією ультрафіолетових променів). На гістологічні зрізи свіжозаморожених або фіксованих органів (тканин) наносять краплю кон`югату - антисироватки, з`єднаної з флюорохромом, і після 20-30-хвилинної експозиції відмивають фізіологічним розчином хлориду натрію Незв`язана флюоресцирующие антитіла. Препарат укладають в забуферений гліцерин або полістирол. Спостереження проводять за допомогою люмінесцентного мікроскопа в ультрафіолетовій частині спектру. Речовини, з якими специфічно прореагували антитіла, виявляють по флюоресценції пов`язаного з останніми флюорохромами.
Поряд з описаним вище варіантом даного методу, який отримав назву прямої імунофлюоресценції, була розроблена інша його різновид - непряма імунофлюоресценція, що характеризується, як правило, більш високу специфічність по відношенню до виявляти субстрату. Метод непрямої імунофлюоресценції відрізняється від прямого методу тим, що частина отриманих після першої імунізації антитіл (А-1) використовують для імунізації другого тваринного, в результаті чого отримують антисироватки, яка містить антитіла (А-2) до А-1. А-2 комплексируется з флюорохромом. На зрізи наносять антисироватки, яка містить А-1, і після відмивання антитіл, незв`язаних з шуканим речовиною, антисироватки, яка містить А-2 (флюоресцирующие). А-2 реагують з А-1 і таким чином «фіксуються» в місцях локалізації досліджуваного речовини.
Електронно-мікроскопічні варіанти иммунофлюоресцентного методу мають деякі особливості. В одних випадках до антитіл імунної антисироватки приєднують будь-якої електронно-мікроскопічний агент (наприклад, атом важкого металу), в інших - з`єднання (групу), що включає в себе радіоактивний атом. В останньому випадку для виявлення локалізації комплексу антиген-антитіло необхідне проведення додаткової авторадиографии.
Метод імунофлюоресценції характеризується великою чутливістю. і дозволяє виявляти речовини, присутні в клітинах і тканинах органу в дуже низьких концентраціях.

Відео: Роль сполучної тканини і Флуревіти, практикуючий лікар Л. А. Вітрик 09. 06.2015 МПО # 39; САД # 39;