Завдання і правила фіксації - основи гістології

Значення і загальні правила фіксації

З огляду на те що позбавлені харчування тканини організму дуже швидко починають зазнавати незворотні зміни (будь то смерть цілого організму або штучне видалення окремих його частин), першими і обов`язковими умовами мікроскопічної техніки є попередження і затримка посмертних змін в тканинах. Це досягається шляхом фіксації взятого для дослідження матеріалу.
Фіксація, як вказує сам термін, є закріплення, збереження в оброблюваному шматочку органу того будови, яке він мав за життя. В основі дії фіксаторів лежать фізико-хімічні процеси ц в першу чергу процес коагуляції білків.
Яка фіксує рідина повинна відповідати двом основним вимогам: 1) досить швидко проникати в тканини і 2) діяти «м`яко», не викликаючи грубих порушень тканинних структур (зморщування, надмірне ущільнення і т. П.). Необхідно також враховувати ту обставину, що тканини і органи хімічний і морфологічно неоднорідні, а їх структурні елементи в свою чергу суттєво відрізняються один від одного, в силу чого фіксує рідина надає неоднаковий вплив на різні компоненти, що входять до складу фіксованої матеріалу.
Зі сказаного випливає, що не існує універсального фіксатора, який би зберігав однаково добре все складові частини клітин і тканин. Одна і та ж фіксує рідина може дати абсолютно протилежний результат (так, спирт добре фіксує глікоген, але зате повністю розчиняє жири).
Більшість фіксаторів надає уплотняющее дію на оброблюваний матеріал. Все це слід пам`ятати і підбирати фіксатор в залежності від цілей і завдань дослідження, а також від особливостей фіксованої матеріалу. Наприклад, для багатьох гістологічних методів хороша формалінова фіксація. Однак при тонких цитологічних і гістохімічних дослідженнях фіксація в формаліні непридатна. Так, при цитологічних дослідженнях вживаються складні фіксатори, до складу яких поряд з формаліном входять осмієва кислота або солі важких металів (кобальт, уран, кадмій, хром, ртуть і т. Д.) Для гістохімічних же досліджень краще брати суміші на спиртовій основі. При деяких дослідженнях необхідно користуватися кількома фіксують рідинами.
Для того щоб успішно здійснити процес фіксації, необхідно дотримуватися певних правил.

1. Розмір досліджуваних шматочків повинен бути таким, щоб відбулося повне його просочування в оптимальні для даного фіксатора терміни. Вирішальне значення при цьому має дифузійна здатність фіксують рідин, яка у різних фіксаторів далеко не однакова. Наприклад, низькою дифузійної здатністю володіють осмій, пікринової кислота, платина, високою - формалін, трихлоруксусная і оцтова кислоти, метиловий спирт і ін. При фіксації тканини печінки 1% осмієвою кислотою протягом
2. ч остання проникає на глибину лише 0,5 - 1 мм, в той час як концентрований формалін за цей же час встигає проникнути на 4 - 5 мм. Отже, для фіксації осмієм треба брати більш тонкі шматочки (3 - 5 мм), ніж для обробки формаліном (10 - 15 мм). В середньому ж для більшості фіксаторів беруть шматочки товщиною 5 - 10 мм.
3. Кількість фіксує рідини має не менше ніж в 20 разів перевищувати обсяг досліджуваного матеріалу, інакше її буде недостатньо для здійснення процесу фіксації, а вода, що входить до складу тканин, може змінити властивості фіксатора.
4. Фіксується об`єкт потрібно поміщати так, щоб забезпечити одночасно його просочування з усіх боків. Для цього шматочки кладуть на скляну або звичайну вату, вміщену на дно посудини, або підвішують, прошив ниткою (або загорнувши в марлю). Дуже дрібні об`єкти, які важко брати пінцетом і можна пошкодити при перенесенні з однієї судини в іншій (тканинні культури та ін.), Слід помістити в тонку скляну трубку і, зав`язавши її нижній кінець марлею, пропустити через пробку, що закриває посудину з фіксатором. У такій «упаковці» об`єкт переносять через всі необхідні середовища.
5. Необхідно суворо дотримуватися час фіксації, яке визначається властивостями рідини, досліджуваного матеріалу і товщиною взятого шматочка.
6. Фіксацію можна вважати закінченою після того, як рідина повністю просякла фіксується об`єкт. Рівномірна забарвлення і однакова консистенція тканин на поверхні розрізу свідчать про те, що процес фіксації завершено.

Слід пам`ятати, що зайве перебування об`єкта в фіксують рідинах негативно позначається на якості одержуваних препаратів, бо тканини стають крихкими, погіршується їх окрашиваемость настає стиснення або набухання і т. Д. Лише деякі фіксатори придатні для тривалого зберігання матеріалу (10% формалін, рідина Буена) .
У більшості випадків фіксацію виробляють при кімнатній температурі. Однак для деяких спеціальних досліджень (особливо гистохимических і електронно-мікроскопічних) застосовують фіксацію охолодженими рідинами при температурі + 4 ° С і нижче.
Крім фіксації шматочків органів і тканин в фіксують рідинах, існує метод прижиттєвої фіксації органів або цілого організму пропусканням (перфузії) фіксатора через кровоносні судини. Цей спосіб особливо цінний для досліджень, при яких потрібно максимально скоротити час між припиненням життєдіяльності досліджуваного об`єкта і початком фіксації (деякі гістохімічні та гістологічні методи), а також зафіксувати цілком великий орган або весь організм.
Для цих цілей необхідно взяти два бутлі, мають випускні пристосування внизу (місткість посудин підбирається в залежності від розмірів об`єкта). На відвідні скляні трубочки, що виступають з нижніх пробок, надягають гумові трубки, які натягують на відгалуження трійника. Бажано, щоб гілки трійника мали крани-якщо ж їх немає, то потрібно пристосувати затискачі до трубок. На решту вільної (відводять) гілка трійника також надягають гумову трубку, з`єднану зі скляною канюлей (розмір канюлі підбирають в залежності від діаметра посудини). Одну з бутлів наповнюють розчином хлориду натрію, іншу - фіксує рідиною. Обидві бутлі закріплюють в штативі на висоті, достатній для забезпечення потрібного тиску рідини (рис. 59). У разі потреби бутлі можна забезпечити манометром і грушею для нагнітання повітря. Коли система підготовлена, її заповнюють, звертаючи особливу увагу на те, щоб ніде не було бульбашок повітря, так як вони можуть закупорити судину і порушити проходження фіксатора. Лише після закінчення всієї підготовчої роботи тварині дають наркоз, прив`язують до станка і оголюють оперативним шляхом артерію і вену підлягає фіксації органу. Артерію беруть на дві шовкові нитки, піднімають, надрізають стінку маленькими гострими кривими ножицями і вводять канюлю по ходу кровотоку.

Мал. 59.

Пристосування для прижиттєвої фіксації за допомогою перфузії фіксують рідин через кровоносні судини.
Закріпивши її за допомогою однієї з ниток, розкривають вену і, відкривши кран, починають пропускати ізотонічний розчин хлориду натрію (периферичний кінець артерії перев`язують залишилася другою ниткою). Як тільки з вени замість крові з`явиться світло рожева рідина, введення ізотонічного розчину хлориду натрію припиняють і починають вводити фіксуючу рідину до тих пір, поки вона не почне витікати з вени. Після цього перев`язують вену і, коли струм рідини з пляшки припиниться, перев`язують артерію. Потім витягують орган і кладуть в фіксуючу рідину. Якщо потрібно фіксувати тварину цілком, то наливку виробляють через аорту або лівий шлуночок серця.
Важливим моментом є перемикання системи з фізіологічним розчином хлориду натрію на фіксуючу рідину. Раннє перемикання призводить до фіксації судин, заповнених кров`ю, що цьому перешкоджає до подальшого проходження фіксатора, пізніше викличе порушення проникності судинних стінок і набряк тканин.