Фіксуючі засоби - основи гістології

Відео: Бази під тіні. У пошуках кращої

Фіксуючі засоби та їх застосування

Застосовувані фіксатори поділяють на дві основні групи: 1) здатні фіксувати речовини (прості фіксатори) -
2) здатні фіксувати суміші (складні фіксатори). Існує велика кількість тих і інших. У цьому посібнику наводяться найбільш поширені фіксатори.

прості фіксатори

Формалін (формол). Формалін є найдешевшим і поширеним фіксатором. У чистому вигляді являє світлу, сильно пахне рідина, що складається з 40% водного розчину формальдегіду. Застосовують переважно у вигляді 10% водного розчину, для чого 1 частина формаліну (т. Е. 40% розчину формальдегіду) розводять 9 частинами води. Готують розчин обов`язково на водопровідній воді, так як дистильована викликає набухання тканин. Широке застосування формалін отримав завдяки ряду властивостей: а) високого ступеня діффузіі- б) здатності добре зберігати форму, забарвлення і структуру досліджуваного об`єкта-в) надавати тривалий фіксує дію (до декількох років), істотно не погіршуючи при цьому якість матеріалу-г) добре зберігати жири і липоиди. Висока дифузійна здатність і незначне облягати дію дозволяють формаліну досить швидко і глибоко проникати в тканини, що дозволяє фіксувати шматочки органу розміром від 1 см і більше, а при необхідності і досить великі органи цілком.
Термін фіксації тканин у формаліні 24-48 ч. Звичайний формалін, як правило, містить домішки метилового спирту і мурашиної кислоти, кількість якої збільшується під впливом світла.
При охолодженні формаліну в розчині з`являється каламуть, що осідає у вигляді білого осаду (параформальдегід). Такий же осад спостерігається на стінках посудини і при випаровуванні формаліну. Тому формалін слід зберігати в темній щільно закривається скляному посуді при температурі не нижче 9 ° С.
Нейтралізація формаліну. Домішка в формаліні мурашиної кислоти надає розчину слабокислий характер, що небажано при застосуванні ряду методів дослідження (деякі гістохімічні реакції, сріблення розчином нітрату срібла). Спосіб нейтралізації формаліну досить простий: в посудину засипають карбонат кальцію (або карбонат магнію) в такій кількості, щоб на дні утворився шар товщиною 1,5-2 см. Потім наливають формалін, кілька разів енергійно струшують і залишають стояти 24-48 год. У протягом цього часу відбувається нейтралізація розчину.
Побічні дії формаліну. Тривале зберігання препаратів в концентрованому розчині формаліну надає тканинам надмірну щільність, що утрудняє подальшу обробку і погіршує якість препарату. Усунути цей недолік можна шляхом приміщення матеріалу на 2 тижні в 1% розчин нітрату срібла або 10% розчин лимонної кислоти. Тривале зберігання в 10% розчині формаліну призводить також до набухання об`єкта, що необхідно пам`ятати при його вимірі після фіксації.
При фіксації формаліном в препаратах нерідко з`являється темно-коричневий кристалічний осад - результат взаємодії формаліну з перебувають в тканинах гемоглобіном. Його видаляють шляхом приміщення нефарбованих зрізів в 1-5% розчин аміаку або 70% етиловий алкоголь на різні терміни (від 5 хв до 4 год). Потім препарат ретельно промивають і ведуть подальшу обробку.
Слід постійно пам`ятати, що тривала дія парів формаліну сильно подразнює слизові оболонки. Змочування шкіри формаліном надає дубильними ефектом, а при повторних частих контактах викликає суху екзему. Тому перед препарування формалінові препарати поміщають в слабоамміачную воду (для усунення запаху) і працюють в гумових рукавичках (при можливості під витяжним пристроєм).
Етиловий спирт. Фіксує дію здійснюється за рахунок відібрання у тканин води і коагуляції білків. Незважаючи на ряд негативних властивостей спирту (зморщування клітин в результаті швидкого відібрання води, розчинення і екстракція жирів і гемоглобіну), він як фіксатор знаходить широке застосування в мікроскопічній техніці. Це пояснюється тим, що етиловий спирт здійснює швидку фіксацію, яка потребує зневоднення тканин перед заливкою в парафін і целлоидин. Будучи хімічно неактивною речовиною, спирт особливо придатний при гістохімічних дослідженнях. У ньому добре зберігаються такі речовини, як муцини, глікоген, сечова кислота, залізо, кальцій, які легко розчиняються в інших фіксуючих рідинах.
Найчастіше застосовують 96% і абсолютний етиловий спирт. Деякі автори рекомендують також концентрації 80 і 90%. Час фіксації залежить від матеріалу: для тонких плівок - 15-30 хв, для шматочків товщиною 3-4 мм - 2-4 ч. У зв`язку з тим що спирт легше води, вона, екстрагуючись з тканин, опускається на дно. Тому під шматочки досліджуваного матеріалу потрібно обов`язково підкладати товстий шар вати. Зайве перебування препарату в спирті викликає надмірне ущільнення тканини, що погано відбивається на подальшій її обробці.
Метиловий спирт (метанол). Безбарвна рідина, в чистому вигляді нагадує по запаху етиловий спирт, технічний же (неочищений) метанол має неприємний запах, обумовленим домішкою інших речовин. У мікроскопічної техніки застосовують у вигляді абсолютного, позбавленого домішок спирту для фіксації мазків крові. Найкраще користуватися метанолом, призначеним для аналізу.
Слід пам`ятати, що метанол є сильною отрутою, тому необхідно дотримуватися правил вживання і зберігання, передбачених для отруйних речовин групи А.
Ацетон. Останнім часом все більше застосування в гістологічних лабораторіях для гістохімічних цілей знаходить фіксація ацетоном завдяки простоті, можливості швидкої фіксації і збереженню після неї багатьох хімічних сполук, в тому числі активності багатьох ферментів. Недолік методу -порушення тонкої цитологічної структури. Застосовувати слід безбарвний (безводний) розчин. Фіксувати можна як шматочки тканин (див. С. 157), так і зрізи. Приготовлені в криостате зрізи розправляють пензликом на предметному склі, переносять в щільно закритий стаканчик з холодним (5-10%) ацетоном і поміщають в лазню з сухим льодом або ж в камеру кріостату. Термін фіксації залежить від товщини зрізів (в середньому 5-10 хв можна зберігати і кілька днів).
З інших фіксуючих засобів слід згадати дихлорид ртуті (сулема), солі важких металів (кобальт, платина, уран і т. Д.) І кислоти (оцтова, трихлоруксусная, пікринова, осмієва, хромова та ін.). У чистому вигляді ці речовини застосовують рідко, але зате вони є складовою частиною багатьох фіксують сумішей.

Відео: Ура! ПРОФ КУПІВЛІ MAC, MAFE, Graftobian, Ben Nye Banana powder

Фіксують суміші (складні фіксатори) і їх застосування

Рідина Мюллера. В даний час застосування її в чистому вигляді обмежено. Однак вона служить вихідним розчином для приготування таких поширених фіксаторів, як рідини Ценкера, Орта, Максимова та ін. Склад:
Біхромат калію 2,5 г
Сульфат натрію 1 г
Вода дистильована 100 мл
Для кращого розчинення біхромату калію рекомендується підігрівати воду.
Рідина Ценкера (сулемова суміш). Один з кращих фіксаторів для приготування оглядових препаратів та препаратів для ряду тонких гістологічних досліджень. Забезпечує хорошу окрашиваемость тканин. Склад і спосіб вживання:
Рідина Мюллера 100 мл Дихлорид ртуті (HgCl2) 5 г Оцтова кислота льодяна 5 мл
(Додається безпосередньо перед употребленіем- може бути замінена рівною кількістю формаліну по Геллі).
Товщина фіксуються шматочків не повинна перевищувати 5 мм. Час фіксації 1-24 год залежно від товщини і властивостей об`єкта.
Подальша обробка. Після ретельного промивання в проточній воді протягом 20-24 год (вода повинна стати прозорою) шматочки поміщають в 70% йодований спирт для видалення з тканин опадів дихлорида ртуті. З цією метою до 70% спирту додають кілька крапель 90% спирту, що містить в 100 мл 2 г йоду і 3 г йодиду калію, до отримання розчину кольору міцного чаю. Відмивання дихлорида ртуті ведуть в декількох працях йодированного спирту, змінюючи його через 18-24 год до припинення просвітлення (розчинення осаду дихлорида ртуті знебарвлює спирт).
Після фіксації рідиною Ценкера рекомендується заливка в целлоидин або целлоидин-парафін, так як заливка в парафін призводить до значного стиснення і сморщиванию тканинних структур.
Рідина Максимова (Ценкер-формол). Фактично являє собою видозмінену рідина Ценкера, в якій крижана оцтова кислота замінена формаліном. Фіксатор широко застосовують для гематологічних досліджень. Дає гарне фарбування клітин крові і дозволяє виявляти їх специфічну зернистість.

Склад і спосіб вживання:
рідина Мюллера
Біхромат калію 2,5 г
Сульфат натрію 1 г
Вода дистильована 100 мл
Дихлорид ртуті 5 г
Формалін 10 мл

Час фіксації 6 ч. Товщина шматочків не більш як 5 мм. Подальша обробка і заливка ті ж, що і після фіксації в рідини Ценкера.
Якщо до рідини Максимова додати 10 мл 2% розчину осмієвою кислоти і збільшити час фіксації до 24 год, можна одночасно отримати осмірованіе жиру.
Примітка. Дихлорид ртуті є сильнодіючою отрутою, тому вживання і зберігання реактиву вимагають дотримання правил, передбачених для речовин групи А.
Фіксація по Навашину-Крилову. Фіксація цим методом дає хороші результати при фарбуванні ядер і протоплазматических структур залізним гематоксиліном. Склад фіксатора Навашина:
Хромової кислоти 1% розчин 10 мл
Формалін 10% 10 »
Вода дистильована 90 »
Оцтова кислота льодяна (додають безпосередньо перед фіксацією) 2 »
Шматочки товщиною 5 мм слід фіксувати 4-6 ч-потім ретельно промити в проточній воді (24-36 ч) для видалення хромової кислоти, залишки якої погіршують забарвлення препаратів.
Г. І. Крилов запропонував перед промиванням проводити шматочки через кілька порцій 5-10% формаліну до припинення жовтого забарвлення розчину (формалін витягує хромовую кислоту з тканин). Ця процедура скорочує терміни промивання у воді.
Рідина Буена. Є одним з кращих фіксаторів. Щодо швидко проникає в тканини, викликаючи незначне (на 2,5%) їх стиснення. Дуже добре забарвлює тканинні структури. Застосовують як для оглядових препаратів, так і для тонких досліджень, а також для фіксації ембріонів.
склад:
Розчин пікринової кислоти насичений 75 мл
Формалін 25 »
Оцтова кислота льодяна 5 »
Зливання перерахованих рідин виробляють безпосередньо перед фіксацією. Так як пікринова кислота погано розчиняється у воді, її насичений розчин необхідно готувати заздалегідь. У посудину насипають 25-30 г кристалічної кислоти і заливають 1 л гарячої дистильованої води. Надлишок кислоти при охолодженні випадає в осад і може бути використаний при приготуванні нової порції розчину. Розчин можна зберігати необмежено довго.
Тривалість фіксації матеріалу 2-24 год залежно від величини об`єкта. Однак і більш тривалий (до декількох діб) перебування шматочків в фіксаторі не погіршує якість фіксації і подальшої обробки.
Після фіксації матеріал переносять в 70-80% спирт (для видалення пікринової кислоти), який змінюють 1-3 рази. Проводять заливку в парафін.
Примітка. Об`єкт, фіксований в рідини Буена, що не просочується повністю целлоидин.
Рідина Карнуа. Служить хорошим фіксатором як для гістологічних досліджень (ядра), так і для багатьох гистохимических методик (нуклеїнові кислоти, білки, полісахариди). Недоліком є легке сморщивание цитоплазми і сполучної тканини.
склад:
Етиловий спирт абсолютний 60 мл (при відсутності можна замінити
96% спиртом)
Хлороформ 30 »
Оцтова кислота льодяна 10 »
Рідина Карнуа готують перед фіксацією. Шматочки товщиною до 5 мм фіксують протягом 1-5 ч (в залежності від товщини об`єкта). Після фіксації шматочки відразу переносять в абсолютний спирт (якщо фіксатор був приготований на 96% спирті, то шматочки слід обполоснути 2-3 рази на 96% спирті, де в разі потреби можна залишити їх на 2-3 ч).
Примітка. Треба стежити, щоб матеріал знаходився в фіксаторі не довше ніж це потрібно для повного його просочування, так як подовження фіксації підсилює стиснення і ущільнення об`єкта.
Фіксатор ФСУ (формалін, спирт, оцтова кислота) Бродського.
Рекомендується для вивчення структури тканин і кількісного цитохимического аналізу нуклеїнових кислот. Перевага ФСУ перед фіксатором Карнуа в тому, що формалін пригнічує активність ферментів, що руйнують нуклеїнові кислоти (нуклеази) в фіксованих клітинах, завдяки чому кількісно краще зберігаються ДНК і РНК.
Склад і спосіб вживання:
Формалін нейтральний нерозведений 3 частини
Спирт етиловий 96% 1 частина
Оцтова кислота льодяна 0,3 частини
Шматочки тканин 2x2 або 2x3 мм-час обробки 1-4 ч залежно від властивостей об`єкта.
Після фіксації шматочки промити водою протягом 12 год або (для цитохимических цілей) протягом того ж часу трьома змінами 70% спирту. Швидко збезводнити і залити в парафін.
Фіксатор Шабадаша. Рекомендується як кращий фіксатор для гистохимического виявлення глікогену (особливо, де його мало, -центральна нервова система).
склад:

Шматочки органу (не більше 3x3 мм) фіксувати 3 ч в першому розчині, потім перенести в другій розчин на 3 ч. Промити в трьох-чотирьох змінах 70% спирту по 2 ч. Залити в парафін або целлоидин.