Підготовка тканин для електронно-мікроскопічного дослідження - основи гістології

У зв`язку з тим, що електронна мікроскопія все ширше входить в дослідну практику морфологічних лабораторій, лаборанту-гістологу необхідний мінімум знань, достатній для того, щоб взяти матеріал і приготувати го нього блоки, які потім можуть бути оброблені фахівцями, які володіють методом електронної мікроскопії.

загальні положення

Принцип обробки об`єкта для дослідження в електронному мікроскопі заснований на тих же положеннях, що і підготовка тканин для вивчення в світлооптичному мікроскопі (фіксація, промивання, зневоднення, заливка, приготування зрізів).
Однак у зв`язку з тим що дослідження ведуть на субмікроскопіческом рівні і за допомогою електронного (а не світового) пучка, методика підготовки об`єкта і техніка отримання зрізу мають деякі особливості про які слід знати.

1. Необхідно зосередити максимум уваги на те, щоб уникнути (або гранично зменшити) змін живих мікроструктур, що викликаються кисневим голодуванням і процесами розпаду, наступаючими при припиненні життєдіяльності об`єкта.
2. З огляду на те що біологічні мембрани, що беруть участь в утворенні більшості живих мікроструктур, мають липоидно-білковий склад, можливе застосування лише тих фіксаторів, що не розчиняють липоиди і білки (чотириокис осмію, формалін, перманганат калію). Такі фіксатори, як спирт, ацетон, дихлорид ртуті (сулема), руйнуючи субмикроскопические структури, унеможливлюють електронно-мікроскопічне дослідження об`єкта.
3. Товщина досліджуваних зрізів не повинна перевищувати 0,3 мкм (300 НМ1), т. Е. Вони повинні бути надтонкими. Зображення об`єкта в електронному мікроскопі виникає в силу різного ступеня відхилення (розсіювання) електронів при проходженні їх через різні за щільністю ділянки зрізу, тому при більшій товщині зрізів на основне зображення будуть накладатися зображення окремих ділянок, розташованих вище (в напрямку електронного пучка), що завжди спричинить за собою втрату чіткості.
4. Для отримання ультратонких зрізів необхідно, щоб матеріал для заливки володів певними властивостями (еластичність, щільність, прозорість та ін.). Зазвичай для електронно-мікроскопічних досліджень об`єкт заливають в синтетичні (полімерні) середовища: епоксидні і поліефірні смоли, а в деяких випадках і в желатин.

1). Нм (нанометр) -1 / 1000мікрона.

Взяття матеріалу і фіксація

Основою фіксації є з`єднання чотириокису осмію з різними структурами об`єкта. Безпосередньо впливати реактивом на тканину не можна, так як відбуваються значні зміни її структурних компонентів. Тому процес фіксації розбивають на два етапи: префиксация і постфіксація. Для кращого збереження структур необхідно застосовувати реактиви, які мають певні pH і ізотонічність, величини яких визначаються видом фіксується тканини. Для префиксации застосовують забуферений розчин глютаральдегіду (зазвичай 3% концентрації). Постфіксація здійснюють в 2% розчині чотириокису осмію.
Перш ніж приступити до взяття матеріалу, слід приготувати всі необхідні розчини.
Префіксатор: до 0,1 м фосфатного буферу (pH 7,4) додати 1% розчин хлориду кальцію (з розрахунку 0,5 мл на 100 мл буфера). Щоб уникнути утворення осаду останній додають по краплях, періодично струшуючи (буфер без хлориду кальцію може зберігатися тривалий час, з хлоридом кальцію - до 2-3 днів). Потім на цій основі готують 3% розчин глютаральдегіду.
Постфіксатор: до 0,1 М фосфатного буферу (pH 7,4) додають чотириокис осмію і розчин глюкози (для створення изотоничности розчину) за такою прописи: 14 мл 6,71% Na2H PCL Н2О- 8,5 мл 2,52% NaOH - 5,5 мл 5,4% розчину глюкози- 27,5 мл 2% розчину чотириокису осмія- 0,3 мл 1% розчину хлориду кальцію.
Приготування 2% розчину чотириокису осмію вимагає особливої ретельності. Ампулу з чотириокисом осмію ретельно миють, потім надпилюють і, сполоснувши дистильованою водою, поміщають в абсолютно чисту темну склянку, куди наливають дистильовану воду в кількості, необхідній для отримання 2% розчину. Після цього чистою скляною паличкою розбивають ампулу (під водою). Виходить прозорий розчин злегка жовтуватого кольору (розчин можна зберігати тривалий час на холоді до випадання в осад темних кристалів).
Крім перерахованих реактивів, необхідно мати батарею спиртів висхідної концентрації (50, 70, 80, 95 і 100%), так як найбільш вживані заливальні середовища - епоксидні смоли Епон і аралдіт - нерозчинні у воді і матеріал перед заливкою необхідно збезводнити. У зв`язку з тим що в процесі обробки застосовують малі кількості розчинів (5-10 мл), рекомендується використовувати посуд відповідної місткості (наприклад, флакончики з-під пеніциліну).
Маючи необхідні реактиви, заливальні середовища і желатинові капсули (№ 1 і 2), можна приступати до роботи.
Існує два основних способи фіксації: 1) прижиттєва перфузия органів 3% розчином глютаральдегіду і 2) шляхом просочування невеликої ділянки досліджуваного органу. Другий спосіб застосовують частіше, так як він технічно простіше і вимагає меншої кількості дефіцитних реактивів. Тільки після закінчення всієї підготовчої роботи можна приступати до взяття матеріалу і його фіксації. Це роблять у такий спосіб. Тварину фіксують і наркотизують нембуталом або ефіром (перший спосіб переважніше). Потім здійснюють доступ до досліджуваного органу (при цьому тварина повинна дихати, а серце його добре працювати).
Префіксація: оголивши поверхню органу, за допомогою шприца наносять на неї 25-30 мл 3% розчину глютаральдегіду, через 5-10 хв вирізують гострим лезом тонку (1 мм) стрічку тканини і подрібнюють в краплі префіксатора, налитого на платівку плексигласу (величина шматочків подрібненої тканини не повинна бути більше 1 мм 3). Потім піпеткою збирають шматочки з краплі префіксатора, переносять в бюкс з новою порцією префіксатора і поміщають на 1-2 год в холодильник. Потім шматочки тканини відмивають в чотирьох порціях фосфатного буфера з хлоридом кальцію по 15-30 хв і приступають до наступного етапу.
Всі ці та наступні маніпуляції необхідно проводити по можливості швидше і при температурі 0-4 ° С, для чого в процесі обробки посуд з розчинами поміщають в чашку з льодом.
Постфіксація: шматочки тканини поміщають в постфіксатор на 2 ч. Після закінчення фіксації виробляють відмивання в чотирьох свіжих порціях фосфатного буфера з хлоридом кальцію по 5 хв.

Відео: Методи вивчення тканин

Зневоднення, просочування і заливка

Зневоднення: шматочки зафіксованої і промитої тканини проводять через батарею спиртів висхідної концентрації в наступному режимі:
Спирт 50% три порції »70%» »

на холоду
Якщо необхідно, то на цьому етапі можна тримати об`єкт до 24 год.
Спирт 80% три порції
»96%» »
»100%» »

при кімнатній температурі
Потім приступають до просочуванню і заливці.
В даний час застосовують кілька способів заливки в синтетичні середовища (аралдіт, Епон, метакрилати, вестопал і ін.).
Наводимо один з найбільш часто застосовуваних способів просочування і заливки в Епон.
Для цього слід приготувати ряд сумішей.
Суміш А: Епон 812 (62 мл) + Епон DDSA (100 мл).
Суміш Б: Епон 812 (100 мл) 4 Епон MNA (89 мл).
У зв`язку з тим що змішуються компоненти мають в`язку консистенцію, необхідно ретельно перемішувати їх в процесі приготування. Кожну суміш можна готувати про запас і зберігати в холодильнику до 1-2 міс.
Перед вживанням беруть рівні кількості сумішей А і Б і додають реактив-ДМР-30 * (з розрахунку на 10 мл суміші А + Б 0,2 мл ДМР-30), знову ретельно перемішуючи до отримання однорідної гомогенної маси.

* Термін зберігання всіх застосовуються компонентів синтетичних середовищ не повинен перевищувати 1 рік.

Просочування: помістити шматочки в середу з 100% спирту і повної суміші Епона (А + Б в співвідношенні 1: 1) на 1 ч. Потім провести через три порції повної суміші Епона (А + Б в співвідношенні 1: 1) по 1 ч в кожній.
На цьому просочування закінчують і переходять до наступного етапу.
Заливка: розливають за допомогою піпетки по капсулах, попередньо просушеним в термостаті, повну суміш Епона (А + Б в співвідношенні 1: 1). Просочені смолою шматочки тканини захоплюють скляній петлею або тонким зігнутим пінцетом і розкладають по одному в кожну капсулу. Не даючи шматочках осісти на дно, капсули ставлять в термостат для полімеризації. Режим полімеризації наступний: 1) при температурі 35 ° С -24 ч-2) 45 ° С - 24 ч-3) 60 ° С - 24 год.
Потім полімеризованною блоки виймають з термостата. Через 1-2 дня блоки відмивають від желатинових капсул. Для цього їх поміщають в банку з гарячою водою на 10-20 хв. Готові блоки затискають в блокодержатель ультратома на добу, заточують в піраміду і приступають до різання матеріалу.

Відео: Діагностика і контроль освітніх результатів на уроках біології в основній школі