Приготування целлоідінових зрізів - основи гістології
Відео: методи приготування препаратів в аюрведичній медицині 1
Відео: яєчко МУЖСКОЄ гістологічну будову TESTIS
Для різання целлоідінових блоків застосовують ножі типу А і В з кутом нахилу дещо меншим, ніж при різанні парафинового блоку. Кут різання повинен бути гострим і залежить від щільності блоку (чим м`якше блок, тим гостріше кут). Закріплення і попередню підготовку блоку виробляють так само, як при отриманні парафінових зрізів. Під час різання ніж і блок постійно змочують 70-80% спиртом. Целлоідіновие зрізи мають меншу, ніж парафінові, схильність до згортання і не прилипають до ножа. Тому у випадках скручування їх можна розправляти пензликом безпосередньо на поверхні ножа.
Готові целлоідіновие зрізи збирають в 70% спирт, де їх і зберігають до наступної обробки, яку можна виробляти як зі свободноплавающими зрізами, так і після попереднього наклеювання їх на предметні скельця. В останньому випадку на відміну від парафінових зрізів наклеювання здійснюють безпосередньо перед фарбуванням. Одним з поширених методів є метод Рубашкіна. Розправлений целлоідіновий зріз переносять за допомогою шпателя на змащене білком з гліцерином предметне скло (при цьому необхідно перенести якомога менше спирту) і притискають складеної гладкою фільтрувальної папером. Потім на зрізи наливають чисте гвоздикове масло. Після того як вони повністю просвітлиться (5-20 хв), масло зливають, предметне скло зі зрізом поміщають в 96% або абсолютний спирт, який змінюють 2-3 рази через 5-10 хв (для набухання целлоидин). Після цього для повного розчинення целлоидин наклеєні зрізи переносять в спирт-ефір або метиловий спирт і потім проводять через спирти низхідній концентрації (до води).
Приготування целлоидин-парафінових зрізів нічим не відрізняється від отримання зрізів при різанні парафінових блоків, наклеювання - також.
РІЗАННЯ НА заморожувати мікротомів
Відео: Мікробіологія. Приготування тимчасових препаратів (Е. Звонарьова)
Зазвичай на заморожувати мікротому ріжуть матеріал, фіксований в формаліні або спирті, а також залитий в желатину. Фіксація в рідинах, що містять дихлорид ртуті, не рекомендується, так як наявність ртуті погіршує якість різання (пошкоджується лезо ножа).
Перш ніж приступити до підготовки матеріалу для різання на заморожувати мікротому, необхідно перевірити, чи є в балоні вуглекислота і надходить вона в заморожують столик. Для цього потрібно відкрити вентиль балона з вуглекислотою і повернути рукоятку, регулюючу подачу газу.
Підлягає різанні фіксований матеріал поміщають в посудину з проточною водою і промивають кілька годин (зазвичай ставлять на ніч). Потім вирізують шматочок товщиною 4-6 мм і кладуть в чашку з дистильованою водою.
Закріпивши малий мікротомних ніж типу С гвинтами в пазах ножедержателя, встановлюють кут нахилу близько 45 ° і відводять в заднє крайнє положення. Потім витягають підготовлений шматочок матеріалу з води, кладуть на зволожену поверхню замораживающей камери або на підкладку з змоченою фільтрувального паперу і орієнтують в потрібному положенні. Після цього короткочасним відкриванням і закриванням крана подачі вуглекислоти виробляють заморожування досліджуваного матеріалу. Для прискорення заморожування камеру з препаратом накривають спеціальним товстостінним склянкою, що входять в комплект мікротома. Якщо такий відсутній, можна пристосувати лабораторний скляний стакан відповідних розмірів. Одночасно із заморожуванням об`єкта слід проводити охолоджування ножа, подаючи вуглекислоту через призначену для цього трубку.
Після закінчення заморожування (про що дізнаються по затвердінню і побілінню препарату) встановлюють Мікрометричними шкалу на потрібну товщину зрізу і, помістивши ніж над об`єктом, обертанням ручки механізму, що подає піднімають столик зі шматочком тканини до рівня леза ножа. Потім рухом ножа за рукоятку на себе починають різання матеріалу. При кожному відведенні рукоятки в крайнє заднє положення столик з препаратом автоматично піднімається на задану висоту. Зріз знімають з ножа пальцем або пензликом і поміщають в чашку з дистильованою водою, де він відразу ж розправляється. Якщо зрізи потрібно деякий час зберегти, то після розправлення в воді їх слід перенести в 10-12% розчин формаліну.
Желатинові блоки ріжуть таким же чином, тільки охолодження їх більш тривалий, а пріморажіванія відбувається краще, якщо накапують на столик не воду, а розчин желатин, призначений для просочування об`єкта. Якість різання також поліпшується, якщо після першого заморожування блоку дати відтанути і потім заморозити його вдруге. Збирати зрізи слід в холодну воду або 30 ° спирт, де вони легко розправляються. При необхідності зберігання зрізи переносять в 10% розчин формаліну.
Отримані за допомогою заморожує мікротома зрізи обробляють переважно свободноплавающими. Однак при необхідності їх можна попередньо наклеїти на предметне скло. Для цього їх поміщають в 30% спирт, потім переносять на предметне скло, змащене білком з гліцерином, розправляють і притискають гладкою фільтрувальної папером, змоченою 30% спиртом. Після цього зрізи переносять в суміш з 50 мл 50% спирту і 7,5 мл формаліну (на 1 хв), ретельно промивають дистильованою водою і забарвлюють.
Отримання хороших зрізів зі свіжого, нефіксованого матеріалу на звичайному заморожувати мікротому утруднено, особливо якщо подальша обробка не допускає фіксації (наприклад, гистохимическое виявлення ферментів).
Останні моделі вітчизняних і зарубіжних заморожують мікротомів мають спеціальні пристосування для охолодження ножа. Якщо мікротом старої конструкції, то охолодити ніж можна, пристосувавши до нього лоточок з сухим льодом.
При різанні нефіксованих заморожених блоків охолодженим ножем зрізи не звертати і можуть бути перенесені холодної пензликом прямо на предметне скло, до якого вони прилипають і прісихают без клеющих засобів.
Як і при заливці в спеціальні середовища, при різанні на заморожувати мікротому можливе одночасне приготування зрізів з двох шматочків. Для цього з порівнюваних об`єктів вирізають шматочки різної форми, мають у своєму розпорядженні поруч на столику, заморожують і ріжуть, Неоднакова форма зрізів дозволяє легко розрізняти їх. Подальшу обробку ведуть також одночасно, а після фарбування порівнювані зрізи укладають на одне предметне скло і готують комбінований препарат.
Однак найкращі зрізи з свіжозамороженої тканини отримують в спеціальному холодильному апараті - криостате.
Основні прийоми роботи з криостате. Перш ніж брати матеріал для приготування свіжозаморожених зрізів в криостате, слід покласти в камеру мікротомних ніж, пензлик, скальпель, препаровальной голку і підставку для стекол, включити кріостат в холодильний агрегат і почекати, поки температура в камері не досягне робочого режиму (-12 -15 °). Потім матеріал поміщають на знятий з мікротома блокодержатель, змочивши попередньо поверхню водою, орієнтують в потрібному положенні і приморожують (можна використовувати сухий лід, вуглекислоту, петролейний ефір, хлоретил).
Якщо матеріал потрібно брати терміново і немає часу чекати, поки кріостат увійде в робочий режим, блокодержатель з примороженим об`єктом слід обернути холодної фольгою або покласти в охолоджений бюкс для попередження вимерзання вологи і помістити в морозильну камеру холодильника (за умови, що температура там не вище - 8-10 ° С). Основна вимога - не дати блоку відтанути. Так само можна зберігати заморожені блоки протягом декількох днів. Перенісши блокодержатель з об`єктом в холодильну камеру, насаджують його на мікротом. Після цього за допомогою вже знаходиться в камері охолодженого скальпеля надають шматочку необхідну форму, закріплюють в мікротому ніж і приступають до різання.
Якщо ступінь охолодження об`єкта підібрана правильно (для матеріалу різної щільності потрібно неоднаковий температурний режим) і протизгортальну пристосування добре відрегульовано, то зрізи добре лягають на ніж. При скручуванні зрізів їх необхідно розправляти на ножі, для чого, як тільки ніж вріжеться в блок, слід злегка притиснути пензликом до ножа початок зрізу і вести ніж донизу в міру зрізання з блоку. Чисте знежирене сухе скло кімнатної температури вносять в камеру і обережно наближають до зрізу. Завдяки різниці температур зріз відривається від ножа і прилипає до предметного скла. Скло зі зрізами підсушують при кімнатній температурі або ж фіксують в різних рідинах в залежності від подальшого методу обробки. При різанні в криостате нефіксованих об`єктів можливе приготування препаратів, суміщених з шести і навіть восьми шматочків. При цьому склеювання і змерзання їх настільки тісне, що кордон важко розрізнити навіть в мікроскоп.
Слід пам`ятати, що для отримання хороших зрізів шматочок повинен бути охолоджений до певного стану. Якщо зріз кришиться, то об`єкт переморожено і потрібно трохи почекати, поки він, відтаючи, не набуде належної твердості. Якщо ж зріз мнеться, то об`єкт недостатньо охолоджений і його потрібно злегка заморозити.
