Просочування і заливка гістологічного матеріалу - основи гістології

Приготування високоякісних гістологічних препаратів вимагає наявності рівномірно тонких зрізів з досліджуваного об`єкта. Для того щоб їх отримати, шматочки тканин треба просочити і залити таким середовищем, яка перетворила б їх в добре ріжучі масу.
Слід пам`ятати, що процес просочування та заливки досліджуваного матеріалу вимагає великої ретельності. Незнання основних принципів і недотримання необхідних умов може призвести до того, що об`єкт виявиться непридатним для різання або отримані зрізи будуть неякісними.
Найбільш вживаними для цих цілей матеріалами є парафін, целлоидин желатин.

Заливка в парафін

Цей метод широко поширений в дослідницьких гістологічних лабораторіях завдяки відносній швидкості заливки (протягом 1-2 днів після зневоднення), можливості приготування серійних зрізів, а також тонких зрізів для цитологічних досліджень (товщина 1-3 мкм), зручності зберігання блоків і нефарбованих зрізів ( практично необмежений час). До недоліків методу слід віднести значне стиснення досліджуваного матеріалу (до 20%), що викликається дією високої температури в процесі просочування парафіном. Багаті водою, пухкі тканини малопридатні до заливання в парафін. Відоме незручність представляє необхідність видалення парафіну з зрізів перед їх фарбуванням.
Парафін при кімнатній температурі - тверде гомогенне речовина. Існує кілька сортів парафіну: м`які (точка плавлення 45-54 ° С) і тверді (точка плавлення 58-60 ° С).
У більшості випадків для заливки застосовують парафін з точкою плавлення 54-56 ° С. Якщо різання передбачається при низькій температурі навколишнього середовища, то краще застосовувати парафін з більш низькою точкою плавлення (48-50 ° С). Потрібна ступінь твердості парафіну досягається змішуванням в різних комбінаціях м`яких і твердих сортів.
Якщо точка плавлення парафіну невідома, її можна визначити. Для цього розплавлений парафін насмоктують в тонкий скляний капіляр і дають йому застигнути. Потім очищають капіляр зовні від прилип парафіну і разом з градусником опускають в хімічний стаканчик з водою, яку починають поступово нагрівати, перемішуючи скляною паличкою. Як тільки парафін в капілярі почне плавитися, відзначають температуру, яка і вкаже точку його плавлення.
Слід пам`ятати, що звичайний продажний парафін часто містить газоподібні домішки, які при заливці утворюють пухирці, які надають парафіну підвищену ламкість і значно погіршують якість різання матеріалу. Для позбавлення від цих домішок свіжий парафін слід на тривалий час залишити в розплавленому вигляді в плоских чашках (щоб збільшити площу для виділення газів) при температурі 70 ° С (для цього можна пристосувати сушильну шафу). Можна також піддавати парафін частому розплавлення і нагрівання (до появи диму) з наступним швидким охолодженням.
Якщо парафін, незважаючи на відповідну підготовку, зберігає жорсткість, до нього слід додати чистий бджолиний віск в кількості 2-5%, що додасть парафіну велику еластичність.
Заливка в парафін вимагає ретельного дотримання двох основних умов: 1) препарат повинен бути повністю зневоднений, 2) не повинен містити спирт. Перша умова, як ми вже знаємо, забезпечується в процесі зневоднення і ущільнення в батареї спиртів підвищується концентрації.

видалення спирту

Для видалення спирту та підготовки до просочуванню парафіном матеріал обробляють одним з розчинників парафіну, що володіє здатністю витісняти спирт. До таких речовин відносяться хлороформ, бензол, толуол, ксилол, сірковуглець та ін. Найчастіше використовують хлороформ і бензол. Толуол і ксилол роблять шматочки твердішими.
Слід пам`ятати, що продажний розливний хлороформ може бути забруднений і містити воду, що є несумісним з вимогами, що пред`являються до речовин, що застосовуються в процесі підготовки об`єкта до просочуванню. Для звільнення хлороформу від спирту і води його наполягають тривалий час над хлоридом кальцію. Зберігають хлороформ в темряві, так як на світлі він легко розкладається.

Методика просочування

Зневоднені і ущільнені шматочки перекладають з абсолютного спирту в суміш абсолютного спирту з хлороформом (1: 1) на 2-3 год, а потім в чистий хлороформ, де вони спочатку плавають (виступаючи над його поверхнею), а потім у міру просочування поступово занурюються. В процесі видалення спирту хлороформ змінюють 2-3 рази протягом 1,5-3 ч (в залежності від властивостей об`єкта і товщини шматочків). При величині шматочка 1 х 1 см його тримають в хлороформі 30 хв. Потім, дотримуючись принципу поступового заміщення хлороформу парафіном, поміщають об`єкт в суміш з рівних частин парафіну (бажано м`якого) і хлороформу. Ця суміш, застигає при кімнатній температурі, при нагріванні до 37 ° С розплавляється і набуває рідку консистенцію. Шматочки знаходяться в хлороформ-парафіні при 37 ° С протягом 5-6 год (при 56 ° С час скорочують до 30 хв - 1 год). При необхідності відстрочити подальшу обробку матеріалу можна після занурення об`єкта в суміш хлороформу з парафіном витягти посудину з термостата і залишити при кімнатній температурі на ніч (або навіть на кілька днів) в закритому стані, а потім, знову розплавивши в термостаті при 56 ° С, перенести в поруч стоїть гарячий парафін для просочування. Зайве перебування об`єкта в розтопленому хлороформ-парафіні погіршує якість різання.

Для повного звільнення об`єкта від хлороформу шматочки проводять послідовно через дві-три порції розплавленого парафіну. Час перебування в парафіні залежить від величини шматочків і властивостей тканини. Шматочки товщиною 2-5 мм повинні в цілому знаходитися в парафіні 2-5 ч.
Якщо об`єкт добре зневоднений і не містить спирту, затримка в парафіні не погіршує якість об`єкта навіть при просочуванні протягом декількох днів.

Мал. 61.
Пристосування для парафінової заливки. Пояснення в тексті.

При наявності ж в шматочках залишків води і спирту результати обробки погіршуються прямо пропорційно тривалості зайвого перебування об`єкта в розплавленому парафіні. Парафін для просочування можна застосовувати багаторазово, але при цьому потрібно строго стежити за тим, щоб не переплутати порції парафіну. Для цього бюкси (або стаканчики) необхідно позначити відповідними цифрами (1, 2, 3).

Заливка.

Після остаточного просочування об`єкта його заливають розплавленим парафіном, спеціально приготованим для цих цілей і зберігаються в термостаті.
Як формочок для заливки використовують різноманітні пристосування.
Г-образні гладкі косинці виготовляють з металу (латунь, свинець, сталь). Рекомендується застосовувати косинці, довга сторона яких дорівнює 8-10 см, коротка - 3 см, висота - 1,5-2 см. Угольники кладуть на відполіровану металеву або скляну пластину і, зрушуючи кути, створюють формочку потрібних розмірів.
Паперові коробочки виготовляють з листка щільного паперу за схемою, представленої на рис. 61, де порядок номерів вказує черговість, а лінії - напрямок згинання листка. Застосовують також фольгу, тільки в цих випадках слід одразу після заливки ще в рідкий парафін занурити частину паперової етикетки. Зручність паперових формочок полягає в можливості значно варіювати їх розміри, простоті маркування (простим олівцем на стінках) і тривалому зберіганні залитого матеріалу.
Для заливки дрібних об`єктів можна застосовувати вартові скла, чотирикутні порцелянові ванночки з-під акварельного фарби і інші пристосування.
Заливку здійснюють наступним чином. Призначений для заливки парафін підігрівають до 58-60 ° С і акуратно наливають в приготовану форму, заповнюючи її по самі вінця і уникаючи утворення бульбашок повітря (добре мати для цих цілей високу порцелянову кружку з ручкою і носиком). Потім підігрівають пінцет або металевий шпатель, швидко переносять підготовлений до заливання об`єкт в формочку з парафіном і орієнтують в необхідному положенні. Після цього формочку охолоджують водою (10-18 ° С). Якщо заливку виробляють за допомогою металевих кутників, то пластину поміщають в плоску чашку таким чином, щоб нижня її поверхня не стикалася з дном судини (на скляні або металеві палички). Потім обережно наливають воду до верхніх країв форми (НЕ заливаючи поверхню) і дають парафіну застигнути. При заливці в паперовій коробочці її поступово опускають в посудину з водою і залишають плавати до повного застигання парафіну.
В процесі застигання поверхню блоку кратерообразной стягується, що необхідно враховувати при виборі висоти форми. Якщо форма недостатньо висока або залита в повному обсязі і парафін лише тонким шаром покриває об`єкт, то при застиганні верхня частина шматочка виступатиме з блоку.
Етикетування матеріалу повинна проводитися безпосередньо перед заливкою, інакше шматочки легко можуть бути переплутані, особливо при заливці декількох об`єктів в одній формі. Для цього при вживанні паперових коробочок відповідні дані наносять простим олівцем на стінку формочки. Якщо ж блок повинен бути витягнутий з форми, то паперову смужку з позначеннями вставляють в парафін до його застигання і, якщо потрібно, роблять додаткові позначки на поверхні застиглого парафіну препаровальной голкою або скальпелем.
Слід пам`ятати, що: 1) при застиганні парафін щільно прилипає до скла і відділяється насилу, тому поверхня скляних пристосувань перед заливкою необхідно змащувати гліцеріном- 2) повільний перенесення об`єкта в форму з парафіном і вживання недостатньо нагрітих інструментів (особливо, якщо в лабораторії прохолодно ) призводить до утворення на поверхні шматочків парафінової плівки, значно погіршує якість залівкі- 3) застосування дуже холодної води (температура нижче 10-8 ° С) призводить до стягання блоку з усіх боків і деформації, а іноді і до трещінам- 4) повільне застигання блоків на повітрі, а також застигання під водою погіршують якість заливки.
При гарній заливці блок повинен мати щільну і однорідну консистенцію. Пухкі молочно-білі включення свідчать про погану якість блоку і значно погіршують різання матеріалу, а іноді роблять її неможливою.
Таким чином, процес заливки в парафін може бути представлений наступною схемою: промивання після фіксації, зневоднення в спиртах зростаючої концентрації (в 50 і 60% по 4-6 ч-в 70, 80 і 90% по 8-12 годин і в двох порціях 100% спирту по 12-24 годин), проведення через суміш з абсолютного спирту і хлороформу (2-3 ч), занурення в чистий хлороформ (дві-три зміни протягом 1 Уг ч), просочування в хлороформ-парафіні (при 37 ° з 3-6 ч), при 56 ° С 30 хв-1 год), просочування в парафіні (в трьох порціях по 1 Уг ч), заливка в парафін1.
У тих випадках, коли за умовами роботи необхідно скоротити час приготування парафінових блоків, можна застосувати прискорену заливку. Для цього шматочок тканини товщиною 1,5-2 мм поміщають в абсолютний (або 96%) спирт або ацетон (для фіксації та зневоднення) на 1-2 год, виробляючи при цьому одноразову зміну фіксатора.
Потім об`єкт проводять протягом 1-1У2 ч через дві зміни чистого хлороформу (підігрітого в термостаті до 37 ° С), перекладають на 30-60 хв в суміш хлороформу з парафіном (1: 1), після чого просочують в парафіні 2 рази (по 45-60 хв) і заливають. При такому режимі весь процес від взяття матеріалу до заливки займає 8-9 ч. Однак якість препарату погіршується в основному в результаті швидкого відібрання води в спирті (або ацетоні). Тому застосовувати цей метод потрібно тільки в крайніх випадках.
Для зменшення витрат праці на гістол9гіческую обробку матеріалу і стандартизацію умов обробки створені різні пристрої, що дозволяють автоматизувати процес підготовки до різання (фіксація, ущільнення, зневоднення, заливка) і навіть забарвлення.
1). Якщо замість хлороформу застосовувати ксилол, то на відповідних етапах терміни скорочуються приблизно в 2 рази.
Принцип їх роботи заснований на автоматичному переміщенні пористого хитається судини з оброблюваних матеріалом через серію склянок, що містять необхідні розчини. Прилади живляться від мережі змінного струму і забезпечені механізмом, здатним виконувати запрограмований режим обробки протягом усього циклу і виключення по його закінченні. Вітчизняна промисловість випускає два типи апаратів - АТ-3 і гістохроматор.
До недоліків приладу слід віднести неможливість індивідуалізації режиму обробки шматочків різних за будовою органів в разі їх одночасної підготовки, неможливість тонкої диференціювання при фарбуванні, велика витрата реактивів при роботі з малою кількістю об`єктів і ін.

Приготування комбінованих парафінових блоків

За останні роки в лабораторній практиці застосовують спосіб одночасної заливки шматочків від декількох порівнюваних органів в єдиний блок. Для цього підлягають спільної заливці об`єкти проводять по спиртової батареї одночасно і на тому етапі, коли необхідно надати шматочках остаточну форму, обрізають їх краї так, щоб в потрібній комбінації вони могли тісно прилягати одне до одного і в той же час мали б різну форму, що дозволяє визначити приналежність кожного об`єкта. Після цього шматочки проводять разом через проміжні середовища, парафіни для просочування і укладають в формочку для заливки в певному порядку, намагаючись зблизити краю в процесі заливки. Схему розташування шматочків і їх позначення відразу ж заносять в протокольний зошит.
Подібні комбіновані блоки можна складати і з уже залитих окремо шматочків, надавши їм в твердому стані необхідну форму і помістивши потім в гарячий парафін, що знаходиться в термостаті. Після повного розплавлення парафіну шматочки заливають разом в єдиний блок. З вдало залитого блоку, що містить два, три, чотири шматочки, можна приготувати хороші, рівні зрізи. Такі комбіновані зрізи незамінні при гістохімічних дослідженнях. Оцінку гистохимической реакції проводять за інтенсивністю забарвлення досліджуваних мікроструктур, а це значить, що порівнювані зрізи повинні мати однакову товщину і перебувати в рівних умовах при проведенні як самої гистохимической реакції, так і інших етапів обробки препаратів. Всі ці умови і забезпечуються при даному способі. Крім цього, значно полегшується мікроскопірованіе препаратів і створюються умови для одночасного вивчення порівнюваних зрізів в загальному полі зору (при малих збільшеннях).
Приготування гістологічних препаратів з комбінованих блоків (звичайно, коли це виправдано) має і ряд техніко-економічних переваг, тому що скорочує час різання і всіх наступних етапів обробки зрізів, а також споживання стекол, реактивів та інших матеріалів прямо пропорційно кількості залитих шматочків.
Наклейку блоків проводять на дерев`яні кубики. Для цього з затверділого парафіну скальпелем вирізують чотирикутний блок таким чином, щоб об`єкт з усіх боків був оточений шаром парафіну товщиною 1-3мм. Потім, поклавши на дерев`яний кубик невеликий шматочок твердого парафіну, розплавляють його гарячим металевим шпателем (або скальпелем), проводять цим же шпателем по нижній поверхні парафинового блоку і швидко притискають його до кубику.

Заливка в целлоидин

Цей метод дуже поширений в практиці патологоанатомічних лабораторій, так як тривале лікування тканин і заливає їх в середу без впливу високої температури дозволяє забезпечувати найкраще збереження мікроструктур. Крім того, при цьому методі немає необхідності видаляти з зрізів заливальне середовище.
Целлоідіновий спосіб також незамінний при дослідженні легко розшаровуються або деформуються матеріалів (стінка трахеї, ціле очне яблуко і ін.). Недоліки методу - тривалість процесу заливки, обмеженість часу зберігання блоків і незручність їх змісту (в спирті), складність отримання тонких і серійних зрізів.
У чистому вигляді целлоидин є речовина, розчинна у суміші з ефіром. Для заливки застосовують 2%, 4% і 8% розчини целлоидин, які необхідно приготувати заздалегідь.
Вихідним матеріалом може служити як готовий - продажний целлоидин в плитках, так і целлоидин, отриманий з кіно-, фото- і рентгенівської плівки. Потрібно відзначити, що не всі сорти кіноплівок можна використовувати для цієї мети. Придатна до вживання плівка повинна розчинятися в суміші абсолютного спирту і ефіру.
Приготування целлоидин з кіно- і рентгенівських плівок починають з видалення емульсійного шару, для чого плівку на 20-30 хв поміщають в теплу лужну воду (10-15% розчин карбонату натрію) і потім миють жорсткою щіткою до повного очищення від емульсії. Після цього плівку ретельно промивають у теплій воді, обполіскують проточною холодною водою протягом декількох годин і висушують при кімнатній температурі. Висушену плівку нарізають в поперечному напрямку ножицями на смужки шириною 5-10 мм і знежирюють в хлороформі протягом 24 год. Потім шматочки поміщають на чисту фільтрувальну папір і сушать 10-12 ч, попередньо накривши листом паперу.
Стандартний целлоидин також попередньо нарізають на дрібні шматочки (або натирають на звичайній кухонній тертці) і висушують на фільтрувальному папері при кімнатній температурі до повного затвердіння (оберігаючи від запилення).

Приготування розчинів.

Для того щоб отримати 500 мл розчину целлоидин, беруть 10 г висушеного целлоидин, насипають в щільно закривається скляну посудину, заливають 250 мл абсолютного спирту і залишають на 24 год, періодично збовтуючи (під дією спирту целлоидин набухає). Потім додають 250 мл безводного ефіру, розчиняє набряклий целлоидин.
Таким же способом готують 4% і 8% розчини. Приготовлені розчини потрібно зберігати в добре закритих посудинах, щоб уникнути випаровування рідкого середовища і зміни концентрації розчину. Найкращими для цих цілей є хімічні склянки з притертими пробками і пришліфованою ковпачками. Шліф ковпачка потрібно змащувати вазеліном. У таких судинах розчини целлоидин можуть зберігатися тривалий час без зміни властивостей.
Слід пам`ятати, що ефір і сухий целлоидин дуже вогненебезпечні, і при роботі з ними вживати всіх запобіжних заходів, передбачених для поводження з легкозаймистими речовинами.
Для приготування целлоідінових розчинів необхідно користуватися тільки безводних спиртом і ефіром, бо навіть незначна кількість води ускладнює просочування об`єкта і порушує процес ущільнення, що в свою чергу погіршує якість блоку. Так як ефір для наркозу не містить води, то він цілком придатний для приготування целлоидин. Технічний ефір нерідко забруднений водою, спиртом і іншими речовинами, тому необхідна його попередня очистка. Для цього в посудину з ефіром засипають гранульований хлорид кальцію (жменю на 1 л) і залишають на 2-3 дня, потім обережно фільтрують. Останню процедуру, якщо є можливість, слід виробляти в витяжній шафі, закриваючи воронку скляною кришкою, щоб уникнути випаровування ефіру (при цьому потрібно пам`ятати про його легкої займистості). У відфільтрований ефір додають металевий натрій (3-5 г на 500 мл) і закривають пробкою, в яку вставлена скляна трубка, заповнена хлоридом кальцію (для забезпечення виходу водню і запобігання попаданню в посудину парів води з повітря). Через 2 дні посудину щільно закривають звичайною пробкою. У такому вигляді ефір можна зберігати тривалий час.
Якщо немає впевненості, що ефір безводний, потрібно провести пробу. У пробірку з 2-3 мл ефіру додають таку ж кількість сірковуглецю і збовтують. Поява каламуті свідчить про наявність води.

Просочування об`єкта целлоидин - досить тривала процедура. Спочатку ретельно зневоднений в абсолютному спирті матеріал поміщають в суміш з рівних частин безводного спирту з ефіром (розчинник целлоидин), потім його переносять в рідкий 2% розчин целлоидин, який послідовно в міру просочування замінюють густішими 4% і 8% розчинами. Тривалість просочування прямо пропорційна щільності тканин і товщині шматочків і варіює від 2 (для нещільного об`єкта товщиною 3-5 мм) до 6-7 днів в кожному розчині. Після закінчення просочування об`єкт переносять в скляну чашку з вертикальними стінками і плоским дном і заливають свіжою порцією 8% розчину целлоидин з таким розрахунком, щоб після зменшення обсягу заливальної середовища вдвічі (згущення до 16% концентрації) над шматочком зберігався шар целлоидин товщиною 2-3 мм . Більш близьке розташування об`єкта до поверхні призводить до деформації препаратів за рахунок сил стиснення, що виникають в процесі згущення розчину.
Потім форму з залитим матеріалом ставлять в ексикатор на сітку, а під неї поміщають чашку з хлороформом, в парах якого і відбувається ущільнення целлоидин до необхідної консистенції. Для того щоб встановити час закінчення цього процесу, на зовнішню стінку чашечки наклеюють паперову смужку з відміткою початкового і кінцевого (вдвічі меншого) рівня розчину целлоидин. Потрібно уникати швидкого згущення і регулювати процес, періодично закриваючи формочку кришкою. Після закінчення ущільнення на поверхню целлоидин наливають 70% спирт і залишають на ніч. Потім вирізують залитий матеріал у вигляді прямокутних шматочків таким чином, щоб навколо об`єкта зберігався шар целлоидин товщиною 2-3 мм. Вирізані шматочки можна зберігати тривалий час в 70% спирті як у вигляді наклеєних на дерев`яні кубики блоків, так і ненаклееннимі. В останньому випадку кожен шматочок загортають у марлю, куди кладуть папірець з відповідним написом, зробленої простим олівцем.
Схематично весь процес від фіксації об`єкта до приготування блоку виглядає наступним чином (при величині шматочка 1 х 1 см і більше).

1. Промивати в проточній воді 24 год.

Мал. 62.
Просочування шматочків целлоидин по Киселі.

1. Збезводнити в спиртах висхідної фортеці (включаючи дві зміни абсолютного спирту) - 12- 24 год в кожному спирті.
2. Помістити об`єкт в суміш абсолютного спирту з ефіром (1: 1) на 4-20 год.
3. Перенести в рідкий 2% целлоидин на 2-6 днів.
4. Перенести в 4-6% целлоидин на 2-6 днів.
5. Перенести в густий 8-10% целлоидин на 2-7 днів.
6. Залити об`єкт свіжим целлоидин.
7. Ущільнити в парах хлороформу в ексикаторі.
8. Залити 70% спиртом, вирізати блоки і помістити їх в 70 ° спирт для зберігання.

Терміни кожного етапу підбирають дослідним шляхом в залежності від властивостей досліджуваного матеріалу, розмірів шматочків і якості целлоидин.
Існує спосіб заливки в целлоидин, при якому просочування виробляють в одній посудині при поступово підвищується концентрації целлоидин (Д. Киселі) (рис. 62). Для цього після перебування матеріалу в двох змінах безводного спирт-ефіру (1: 1) його поміщають в щільно закривається шірокогорлую посудину, в який наливають відомий обсяг (50 або 100 мл) свіжого спирт-ефіру. Потім в мішечок з марлі насипають подрібнений сухий целлоидин в такій кількості, щоб при повному його розчиненні концентрація розчину дорівнювала 8-10% (5 г на 50 мл). Мішечок підвішують за нитку так, щоб тільки його нижня поверхня омивалася спирт- ефіром, після чого посудину щільно закривають пробкою. Целлоидин поступово розчиняється і безперервно підвищує концентрацію розчину. Термін просочування 4-10 днів. Якщо потрібно прискорити розчинення целлоидин, банку злегка нахиляють, якщо уповільнити - піднімають мішечок. Після закінчення просочування об`єкт заливають звичайним способом.
Слід знати, що швидка поява на поверхні целлоидин щільної плівки (під час згущення) свідчить про наявність в целлоидин води. При таких умовах ущільнення буде нерівномірним і середовище помутніти, що значно погіршує якість різання і забарвлення. Рекомендується звільнити матеріал від целлоидин (помістивши в безводний спирт-ефір) і залити новою порцією безводного целлоидин.
Якщо в процесі згущення в целлоидин з`являться бульбашки повітря, то потрібно на його поверхню налити безводний спирт-ефір і прикрити чашечку кришкою. Зазвичай після цього бульбашки виходять на поверхню самі, якщо ж ні, то їх видаляють препаровальной голкою. Правильно приготовлений целлоідіновий блок повинен бути майже прозорим і мати консистенцію шкільної гумки.
Якщо ж за умовами роботи необхідно скоротити час приготування целлоідінового блоку, то можна застосувати метод прискореної заливки. Для цього тонкі шматочки досліджуваної тканини (товщиною не більше 2 мм) витримують в двох-трьох змінах 96% (або абсолютного) спирту протягом 6-8 ч (загальний час), після чого поміщають на 12-16 год в густий (10 12%) целлоидин. Потім вирізують блок, наклеюють на дерев`яний кубик, ущільнюють під скляним ковпаком, поклавши поруч шматочок вати, змоченої хлороформом, протягом 1-1х / 2 ч. Зберігають, як зазвичай, у 70% спирті.
Слід пам`ятати, що якість зрізів, приготованих з таких блоків, значно гірше, ніж з блоків, залитих звичайним способом. Застосовувати метод прискореної заливки потрібно лише в крайніх випадках.
Наклейка целлоідінових блоків. Дерев`яні кубики, призначені для наклейки целлоідінових блоків, необхідно попередньо обробити з метою видалення з них екстрагованих речовин. В іншому випадку ці речовини при зберіганні блоків в спирті переходять в розчин (або безпосередньо в целлоидин), що значно погіршує якість блоків.
Найбільш поширений спосіб полягає в наступному. Багаторазово кип`ятять дерев`яні кубики протягом декількох днів (після кожного кип`ятіння змінюють воду), потім кілька днів витримують в 70-80% спирті (або спирт-ефірі), після чого ретельно висушують.
Підлягає наклейці целлоідіновий блок виймають зі спирту, промокають фільтрувальної папером і поміщають нижньою поверхнею в суміш спирту і ефіру (1: 1) до початку розчинення целлоидин (1-2 хв). Потім на поверхню дерев`яного кубика (доцільно зробити її шорсткою) наносять скальпелем або шпателем кілька крапель 12-16% целлоидин, в який занурюють блок. При цьому потрібно уникати сильного прідавліванія блоку, так як витісняється рідкий целлоидин блок приклеюється неміцно. Наклеєні блоки через 5-10 хв кладуть в широкогорлую банку з 70% спиртом, де вони можуть зберігатися тривалий час. Попередньо їх маркують простим олівцем.
При тривалому зберіганні блоків необхідно стежити за кольором спирту і в разі появи жовтуватого забарвлення виробляти заміну його свіжою порцією, так як перебування в жовтому спирті погіршує забарвлення препаратів.

Заливка в целлоидин-парафін

Цей метод поєднує в собі переваги парафіну і целлоідіновой заливок. Застосовувати його рекомендується при обробці: 1) ніжних об`єктів, які легко стискуються при парафінової заливки (мезенхимная тканину, органи кровотворення і ін.) - 2) органів, які розшаровуються при різанні в парафіновому блоці (трахея, шкіра та ін.).
Метод. Промивання і зневоднення стандартні. З безводного спирту матеріал поміщають в суміш з рівних частин спирту і ефіру (4-20 год), а потім в 2% розчин целлоидин. Після повного просочування (24-48 год) об`єкт переносять в чистий хлороформ, де він знаходиться до тих пір, поки не зануриться під його поверхню (30 хв - 1 год). Потім матеріал на такий же час переносять в свіжу порцію хлороформу (час підбирають в залежності від розміру шматочків і властивості матеріалу). Після цього об`єкт промокають фільтрувальної папером і переносять в розтоплену суміш хлороформу з парафіном, в якій тримають 20 хв при температурі 58 ° С (після занурення шматочка посудину можна залишити на столі до ранку і навіть на кілька днів). Наступні просочування і заливка, як при звичайному парафіновому методі.
Існує модифікація цього методу, згідно з якою просочують матеріал в суміші з рівних частин 2% розчину целлоидин касторової олії 1-3 дні.
Потім об`єкт переносять в хлороформ, який змінюють тричі через 1 год (для видалення касторової олії). Наступні етапи, як і при парафінової заливки. Цей метод рекомендується застосовувати для заливки щільних об`єктів (шкіра, трахея).

Заливка в желатин

Метод придатний для ембріологічних досліджень, заливки пухких тканин і органів (не викликає зморщування), при дослідженнях з метою виявлення жирів і ліпоїдів. Ріжуть желатиновий блок тільки на заморожувати мікротому.
Для заливки готують два розчини: а) 25% розчин - 25 г подрібненого або порошкоподібного желатину розчиняють в водяній бані (при 37 ° С) в 75 мл 1% розчину фенолу (щоб уникнути випаровування посудину повинен бути закритий) - б) 12,5 % розчин - 1 частина густого розчину розбавляють 1 частиною теплого 1% розчину фенолу, для приготування якого в 100 мл дистильованої води розчиняють 1 г фенолу при постійному збовтуванні.
Приготовлені розчини желатину розливають в окремі пробірки або інші невеликі судини порціями, придатними для однієї заливки (розчин використовують одноразово, так як повторне розплавлення погіршує застигання), і щільно закривають пробкою.
Метод. Ретельно відмитий від фіксатора матеріал переносять для просочування спочатку в рідкий (12,5%) розчин желатину на 3-20 год (в залежності від товщини і властивостей об`єкта), потім на такий же термін в густий (25%) розчин (всю процедуру проводять в термостаті при 37 ° С, в добре закритих пробками баночках во, щоб уникнути випаровування води і загустіння желатину, після чого заливають свіжою порцією 25% розчину желатину), поміщають в попередньо підігріті формочки і охолоджують у воді, уважно стежачи, щоб вона не потрапила в желатин (влітку воду слід попередньо остудити в холодильнику). Після затвердіння желатину з нього вирізають квадратні блоки, які для ущільнення поміщають на 24 ч в 20-25% розчин формаліну і потім зберігають в 10% розчині формаліну.
Якщо ущільнення блоку в формаліні починають занадто рано, то він робиться слизьким або ламким. Для видалення желатину з зрізів їх поміщають в 10% розчин гідроксиду калію (КОН) на 30 хв і тримають в термостаті при 37-40 ° С.
Потім зрізи грунтовно промивають у водопровідній воді і фарбують. Повного видалення желатину з зрізів при цьому не відбувається.