Виявлення полісахаридів - основи гістології

Виявлення полісахаридів (кислих і нейтральних)*
Полісахариди - високомолекулярні цукру, зустрічаються в тканинах організму як в чистому вигляді (глікоген), так і в поєднанні з іншими речовинами (мукополісахариди, мукопротєїди, глікопротеїди). Глікоген є резервом цукру в організмі і міститься головним чином в печінці і м`язах. Мукополісахариди - це полісахариди, що містять в якості одного з компонентів гексозамін. Вони є істотним компонентом слизоподібною речовин в організмі, чому і отримали свою назву (лат. Mucus - слиз).

* Кислі мукополісахариди тепер називають глікозаміногліканами, а нейтральні - гликопротеидами. Однак ми залишаємо в тексті старі терміни, так як вони фігурують в більшості існуючих методичних посібників з гистохимии.

Мукополісахариди поділяють на нейтральні і кислі. Останні поширені у тваринному організмі дуже широко (слиз епітелієм травного тракту і проток більшості залоз, основна речовина сполучної тканини і т. Д.), Їх в свою чергу ділять на прості (гіалуронова кислота) і складні (мукоітінсерная і хондроітинсірчана кислоти-гепарин). Мукополісахариди, міцно пов`язані з білком, називають мукопротеидами і гликопротеидами. Вони входять до складу слизоподібною речовин і секрету ряду залоз.
Полісахариди і їх комплекси - вельми лабільні сполуки, що чутливо реагують на різноманітні зрушення обмінних процесів в організмі.
Речовини полисахаридной природи відіграють важливу роль у забезпеченні нормальних фізіологічних процесів і займають провідне місце в розвитку ряду патологічних процесів, особливо пов`язаних із захворюванням сполучної тканини. Тому вивчення динаміки зміни змісту і розподілу різних полісахаридних компонентів в організмі має велике значення в дослідницькій практиці, а виявлення і диференціювання полісахаридів - одні з істотних розділів гистохимии.

Реакція - Шифф-йодна кислота (ШИК-реакція)

В основі гистохимии речовин, що містять полісахаридних компонент, лежить реакція Шифф-йодна кислота (ШИК-реакція).
За допомогою цієї реакції можна виявити глікогени, мукопротєїди, глікопротеїди і гліколіпіди.
робочі розчини
Реактив Шиффа (спосіб приготування див. Вище - с. 270).
Сірчиста вода. До 200 мл дистильованої води додати 4 мл концентрованої НС1. У 25 мл дистильованої води розчинити 4 г безводного сульфіту натрію. Обидва розчини з`єднати.
Розчин перйодати. Розчинити 1 г перйодатом або 2,5 г перйодати натрію в 100 мл дистильованої води.
метод
(Фіксатори Шабадаша, спирт, формалін, рідина Карнуа, рідина Ценкера- заливка в парафін, заморожені зрізи).

1. Зрізи товщиною 5-7 мкм Депарафінірованние і довести до води.
2. Занурити в розчин йодної кислоти на 5-10 хв або перйодати натрію або калію на 20-30 хв.
3. Ретельно промити в двох-трьох порціях дистильованої води (по 3-5 хв), щоб видалити залишок йодної кислоти.
4. Помістити в реактив Шиффа на 10-20 хв.
5. Обробити в трьох порціях свежеприготовленной сірчистої води (по 1-2 хв).
6. Промити у водопровідній воді протягом 10 хв, обполоснути в дистильованої.
7. Збезводнити, просветлить і укласти в бальзам (якщо потрібно пофарбувати ядра, то після шостого етапу виробляють докрашіваніе зрізів гематоксиліном).

Результат. Речовина полисахаридной природи забарвлене в пурпурно- або лілово-червоний колір. Нейтральні мукополісахариди бувають зазвичай пурпурно-червоними, глікоген - темніший.
Примітка. Обробку реактивом Шиффа слід проводити в добре закритих біологічних стаканчиках, обгорнутих в чорний папір. Одну порцію реактиву можна застосовувати багаторазово (до появи червонуватого забарвлення).
Якщо на зрізах з`являються брудно-коричневі плями, це свідчить про те, що окисляє розчин не був повністю промитий перед обробкою зрізів реактивом Шиффа.

Відео: Цикл біохімії Усачова Степана. Основи біохімії Лекція 1 Загальна біохімія амінокислот і білків

Диференціація речовин, що дають ШИК-позитивну реакцію

ШИК-позитивну реакцію, крім глікогену, дає група речовин полисахаридной природи -гліколіпіди, глікопротеїди, мукопротєїди, а також деякі речовини, що не містять вуглеводів: фосфоліпіди, ліпопротеїди і деякі ліпіди. Тому, для того щоб визначити, яке з речовин присутня в досліджуваних тканинах в кожному конкретному випадку, необхідно провести додаткові реакції для уточнення ШИК-позитивних речовин.
Розщеплення глікогену. Застосовують готовий препарат діастазу або фермент, що міститься в слині.
У першому випадку до 0,1% 0,02М розчину діастази в фосфатному буфері з pH 6,0 додають хлорид натрію (кухонна сіль) до концентрації 0,8%, у другому збирають кілька кубиків слини і фільтрують в стаканчик.
Метод. 1. Після депарафінірованія і доведення до води один-два зрізу поміщають в розчин діастази (або слини) і ставлять в термостат при 37 ° С на 30-60 хв, інші залишають у воді.

Відео: Biological Molecules - You Are What You Eat: Crash Course Biology # 3

1. Промивають зрізи в дистильованої воді разом з іншими зрізами (необробленими ферментами) і піддають ШИК-реакції за описаним методом.

Результат. 1. Відсутність забарвлення в зрізах, інкубованих в розчині, що містить фермент (контрольні), свідчить про те, що ШИК-позитивна реакція в інших зрізах обумовлена наявністю в тканинах глікогена- 2) якщо всі зрізи пофарбовані однаково, це означає, що глікоген відсутня і забарвлення зумовлене іншими речовинами, що дають ШИК-позитивну реакцію- 3) якщо контрольні зрізи пофарбовані менш інтенсивно, ніж інші, слід вважати, що частина ШИК-позитивного матеріалу складає глікоген.
Реакція ацетилювання. Контрольні зрізи обробляють протягом 1-24 год при 21 ° С в суміші мл оцтового ангідриду і 24 мл сухого піридину, промивають водою, обробляють протягом 1 год в розчині гідроксиду натрію (0,4 мл NaOH на 100 мл дистильованої води), промивають в воді і проводять ШИК-реакцію. Негативні результати вказують на те, що первісна реакція була зумовлена присутністю вуглеводних речовин (1-2 гліколеві групи).

Екстракція ліпідів. Зрізи витримують в тління 29 год в суміші з різних частин хлороформу і метанолу при 58 ° С. Якщо при ШИК-реакції забарвлення зникає або зменшується, то вона була обумовлена ліпідними речовинами.
Реакція - Шифф-надуксусная кислота. Зрізи, попередньо оброблені 1-2 ч в розчині надмуравьиной або надуксусной кислоти, потім фарбують реактивом Шиффа. Наявність в них структур, червоною барвою, вказує на вміст ліпідів з ненасиченими зв`язками (фосфоліпіди або цереброзидів).
Обробка зрізів трипсином. Якщо в попередньо оброблених трипсином зрізах зникає або зменшується ШИК-позитивна реакція, то вона була обумовлена білковими речовинами.

Виявлення глікогену карміном за методом Беста

 (Фіксатори - Буена, Карнуа, спирт, формалін та ін.)
робочі розчини
Основний розчин карміну. Розчинити в 60 мл дистильованої води 2 г карміну, 1 г карбонату калію і 5 г хлориду калію. Отриманий розчин кип`ятити протягом 5 хв (не допускаючи бурхливого кипіння), охолодити і процідити. Потім додати до фільтрату 20 мл 28% розчину аміаку. Що зберігається в холодильнику при 0-4 ° С розчин придатний протягом 3 міс.
Розчин карміну для фарбування. Злити 8 мл основного розчину, 12,5 мл аміаку (щільність 0,880) і 24 мл метанолу (розчин придатний 1-2нед).
Розчин Беста для диференціювання. До 8 мл абсолютного спирту додати 4 мл метанолу та 10 мл дистильованої води.
Метод фарбування (парафінові зрізи)

1. Довести зрізи до абсолютного спирту.
2. Помістити в 1% розчин целлоидин на 2-5 хв.
3. Висушити на повітрі.
4. Довести через спирти до води.
5. Пофарбувати гемалауном Ерліха 5 хв.
6. Обполоснути у воді і отдифференцировать забарвлення ядер в 1% подкисленном спирті.
7. Обполоснути в дистильованої воді.
8. Помістити в карміновий розчин для фарбування на 15-30 хв.
9. Диференціювати в розчині Беста (НЕ ополіскуючи попередньо у воді) від 5-10 с до кількох хвилин, поки не перестануть відходити хмарки барвника (якщо розчин швидко забруднився, то змінити).
10. Промити в 80% спирті.
11. Збезводнити, освітлити і укласти в бальзам.

При фарбуванні целлоідінових зрізів перші три етапи опускаються, так як вони призначені для забезпечення целлоідіновой захисту зрізів.
Результат. Ядра темно-сині, глікоген яскраво-червоний.
Примітка. У зв`язку з тим що до складу барвника входить аміак, забарвлення слід проводити в щільно закритих посудинах. Контрольні зрізи обробляють діастазою так само, як при ШИК-реакції.

Відео: Біологія. Виявлення жирів в крупах. Відео 2