Приготування пленчатих препаратів - основи гістології

Відео: Bioefekts: Мікробіологічні препарати для с / г

У тих випадках, коли необхідно вивчити мікроскопічну структуру об`єкта, що має плівчасте будова (серозні і мозкові оболонки, сполучнотканинні мембрани і т. Д.), Готують цілісні (тотальні) препарати. Для цього січуть підлягає дослідженню ділянку плівки і щоб уникнути утворення складок перед фіксацією наколюють в розправленому стані на воскову (або коркову) подушку (див. С. 153).
Після закінчення фіксації матеріал обробляють звичайним способом: відмивають фіксатор, фарбують, зневоднюють, просвітлюють і укладають у відповідні середовища.

Прижиттєва (вітальна) забарвлення тканин

Описані в попередніх розділах методи обробки матеріалу для мікроскопічного вивчення органів і тканин мають істотний недолік: перед дослідником завжди статичний стан об`єкта, зафіксоване в момент або після припинення процесів життєдіяльності. Природно прагнення біологів мати на озброєнні методи, що дозволяють вести спостереження за живими органами і тканинами. Така можливість відкрилася з введенням в практику методів прижиттєвої забарвлення досліджуваного об`єкта.
Основні вимоги до прижиттєвим барвників: мінімальна токсичність і виборче фарбування окремих структурних елементів клітин і тканин.
Знаючи особливості розподілу в тканинах тих чи інших барвників при нормальному функціонуванні організму, можна визначити різні відхилення, що настають при
тих чи інших патологічних станах. Значну допомогу надають вітальні барвники в ембріологічних дослідженнях при вивченні розвитку, так як можна успішно вести спостереження за переміщенням забарвлених клітин. Сказане повною мірою відноситься і до вивчення тканинних культур (вирощування шматочків органів і тканин на спеціальних поживних середовищах).
Як і звичайні гістологічні барвники, все барвники для прижиттєвої забарвлення поділяють на основні, кислотні і нейтральні.
Основні барвники сприймаються багатьма клітинами, але особливо добре клітинами і структурами, багатими ліпоїдами. Саме остання властивість забезпечує хороше прижиттєве фарбування основними барвниками нервової тканини.
Кислотні барвники забарвлюють лише деякі види клітин і в першу чергу клітини ретикулоендотеліальної системи, що володіють високою фагоцитарної активністю. Ці клітини відіграють важливу роль в захисної реакції організму. Їх здатність накопичувати прижиттєво частки кислотних барвників дозволяє широко застосовувати вітальне фарбування для вивчення їх функціонального стану. До таких барвників відносяться трипановий синій, туш, літієвий кармін.
Існують різні способи застосування вітальних барвників. Великим лабораторним тваринам фарбувальні розчини вводять шляхом внутрішньовенних, внутрішньочеревно або підшкірних ін`єкцій, причому швидкість забарвлення залежить від способу введення (найбільша - при внутрішньовенному, найменша - при підшкірному). Жабам барвник вводять в спинний лімфатичний мішок або черевну вену. Забарвлення дрібних водних тварин виробляють підфарбовування води в акваріумі.
Застосовують також метод введення барвника через рот, підмішуючи його в їжу.
Зазвичай барвники розчиняють в дистильованої воді або фізіологічному розчині хлориду натрію. Однак самим ідеальним розчинником є сироватка крові відповідного тваринного, що забезпечує краще всмоктування барвника. Для отримання такого розчину в стерильних умовах готують 1% сироватковий розчин відповідного барвника, центрифугують його (3000-3500 об / хв) і відсмоктують надосадову фракцію піпеткою.
Освоєння техніки вітального фарбування найзручніше в процесі забарвлення сполучної тканини білих щурів (або мишей) трипановим синім.
Приготування розчину. Розчиняють 1 г трипанової сині в 100 мл ізотонічного розчину хлориду натрію (або дистильованої води). Придатність розчину при зберіганні в прохолодному місці 3-4 тижні. Перед вживанням розчин барвника фільтрують, стерилізують (кип`ятінням протягом 10-15 хв) і дають охолонути до 25-35 ° С. Одночасно стерилізують двограмових шприц і голки.
Підшкірна ін`єкція. Помічник захоплює корнцангом шкіру піддослідного щура на потилиці, а другою рукою бере тварину за кінчик хвоста і розтягує на столі спинкою догори. Експериментатор, набравши в шприц розчин барвника (з розрахунку 0,5 мл на 20 г маси тіла), вільною рукою відтягує шкіру на спині (або на бічній поверхні тіла тварини) і, встромивши під шкіру голку, вводить барвник. 
Введення внутрибрюшинно. Помічник бере щура так само, як в попередньому експерименті, але витягує її вертикально вниз головою. При такому положенні тіла відбувається переміщення органів черевної порожнини до діафрагми, що дозволяє легко проникнути в черевну порожнину без пошкодження нутрощів. Голку вводять в ліву нижню половину стінки живота під гострим кутом (зверху вниз). Спосіб швидший і простіший, ніж прив`язування за лапки в положенні на спині. Концентрація і кількість барвника ті ж, що і при підшкірному введенні.
Внутрішньовенне введення. Можна проводити в хвостову або яремну вени, попередньо прив`язавши щура в спеціальному верстаті черевцем догори. Кількість барвника вдвічі менше, ніж при двох попередніх способах, концентрація та ж. При вдалій одноразової внутрішньовенної ін`єкції гарне фарбування настає вже через 24 год, при всередині брюшинной - через 48 год. Підшкірне введення зазвичай повторюють кілька разів через 3-4 дня. Наступ загального фарбування легко визначити по посиніння слизових оболонок і райдужки очей. Загальна посиніння шкірних покривів настає дещо пізніше.
Тварина забивають одним з прийнятих способів (декапитация, ефір або хлороформ), проводять розтин і беруть підлягають дослідженню органи і тканини.
Фіксація. Фіксація відклався в тканинах трипанового синього найкраще настає при застосуванні складних фіксаторів - Буена (с. 165), Штіва і ін. Проте, якщо такі відсутні, можна застосовувати і формалін. При цьому слід мати на увазі, що ніжні гранули знебарвлюються, а барвник дифундує в інші структури. Пробні препарати можна приготувати з зрізів, отриманих на заморожувати мікротому. Зазвичай же матеріал заливають в парафін, готують зрізи товщиною 5-7 мкм і підфарбовують: при застосуванні трипанового синього (або туші) - карміном або нейтральним червоним, при застосуванні літієвий карміну - метиленовим синім і ін. Потім зневоднюють, просвітлюють і укладають в бальзам.