Імпрегнація елементів макрогліі - основи гістології

Імпрегнація елементів макрогліі (астроцитів)
Кращим методом є імпрегнація астроцитів хлоридом золота за методом Кахаля. Фіксацію матеріалу проводять в 12% розчині формаліну або краще в спеціальному бромистого фиксаторе, що складається з 14 мл формаліну (міцний нейтральний), 2 г броміду амонію і 100 мл дистильованої води.

Фіксація триває 2-8 днів (не довше ніж). Потім необхідна промивка у водопровідній воді і різання на заморожувати мікротому. Товщина зрізів 20-30 мкм. Прямо з мікротомних ножа зрізи переносять знову в бромідний фіксатор і протягом 2 діб витримують у термостаті при 37 ° С. Після цього швидко промивають в дистильованої воді і переносять в імпрегніруются суміш наступного складу.
Розчин хлориду золота
1% 10 мл
Розчин дихлорида ртуті кристалічної 5% 8 мл
Дистильована вода 50 мл
Суміш повинна бути свіжоприготованою і перебувати в посуді з темного скла.
У цій імпрегніруются суміші зрізи витримують 2-8 ч. Зрізи повинні лежати вільно, в розправленому стані.
Для цього необхідно в 25 мл суміші класти не більше 5-8 зрізів. В процесі імпрегнації зрізи стають коричневими з червонуватим відтінком. Якщо імпрегнація буде слабка, можна тримати зрізи в цьому розчині добу і більше.
Для фіксації металевого золота в структурах зрізів останні поміщають в 10% розчин тіосульфату натрію на 15-20 хв, де зрізи стають блідіше і приймають фіолетове забарвлення. Потім їх промивають в 40-50% спирті, швидко проводять через абсолютний спирт, ксилол і укладають в бальзам. Метод, як правило, надійний. Невдачі можуть залежати від поганої фіксації або забрудненості реактивів. Оптимальна температура для імпрегнації 20 ° С.
Результат. Астроцити за відростками краснофіолетового, сіро-фіолетового або коричневого кольору.

Імпрегнація елементів мікроглії по В. К. Білецькому

Дає можливість импрегнірованого також гістіоцити не тільки мозку, але і печінки, підшкірної клітковини, адвентіціальние клітини капілярів і т. Д.
Метод заснований на імпрегніруются здатності аміакати срібла. Необхідно дотримуватися всіх умов, про які говорилося вище при описі методу Більшовского-Грос в модифікації Б. І. Лаврентьєва (чистота реактивів і посуду).
Фіксація матеріалу: 10% розчин формаліну, краще нейтрального (до 5 днів). Матеріал, фіксований нетривало, імпрегніруются краще, ніж старий.
Після фіксації матеріал необхідно добре обмити в проточній водопровідній воді (24 ч), а потім в дистильованої (30 хв). Далі матеріал можна: 1) не укладаючи, різати на заморожувати мікротоме- 2) укласти в желатін- 3) укласти в целлоидин.
Необхідно відзначити, що найкращі результати дає метод з укладенням в желатин (карболовий або простий), але при відомій навичці отримують хороші препарати і без укладення. Зрізи роблять на заморожувати мікротому (товщина зрізів 10-20 мкм) і проводять через дистильовану воду.
Для імпрегнації необхідно мати свіжоприготований 10% розчин нітрат-аміакати срібла і 10% розчин нейтрального формаліну.
Роботу проводять в чотирьох широких бюксах. У перший наливають 10% розчин аміакати срібла, в другій - дистильовану воду, в третій - 10% розчин нейтрального формаліну, в четвертий - дистильовану воду. Зрізи переносять з дистильованої води в перший бюкс з аміакати срібла на 20-30 с, потім в дистильовану воду (другий бюкс) на 1 с і після цього - в третій бюкс (з формаліном). Всі ці маніпуляції роблять швидко, щоб зріз не лежав у воді більше 2 с. Срібло в формаліні має повільно відновлюватися: зріз спочатку темніє, потім стає сіро-жовтим або коричнево-жовтим. Потім зрізи поміщають в четвертий бюкс з дистильованою водою, звідки їх виловлюють на предметне скло і розглядають при слабкому збільшенні мікроскопа.
При слабкій імпрегнації слід довше (годинами) витримувати зрізи в формаліні в останньому бюксе. Якщо гістіоцити зовсім не виявилися, треба відзначити, які структури видно на зрізі. Можна вживати гарячий формалін: він швидко відновлює срібло. Якщо зрізи білі (білі плями) або злегка жовті і якщо в них видно лише окремі ядра або взагалі структур не видно, значить, матеріал «кислий». В цьому випадку зрізи перед імпрегнацією потрібно покласти на 20- 30 хв (можна до 1 добу в залежності від ступеня кислотності) в аміачну воду (3-4 мл аміаку на 50 мл води) і після промивання проводити імпрегнацію.
На зрізі можуть осідати гранули (зерна) або пластівці срібла і виявлятися багато ядер, це означає, що умови імпрегнації занадто «кислі» для даного матеріалу. Цього можна уникнути: а) збільшенням часу імпрегнації в нітрат серебра- б) ощелачиванием розчину нітрату срібла. Знаючи, що при повному розчиненні всього осаду нітрату срібла аміаком розчин виходить слаболужною, можна збільшувати лужність розчину, доливаючи по краплях аміак, або зменшувати лужність, додаючи по краплях 1% розчин нітрату серебра- в) підігріванням формаліну і зменшенням його концентрації до 1-5 %. Зрізи в міру необхідності можна опускати в теплий або гарячий формалін.
Якщо зрізи в формаліні швидко темніють або навіть чорніють, то матеріал «лужної». Можна звільнити матеріал від зайвої лужності, поміщаючи зрізи перед імпрегнацією в 1-2% розчин оцтової кислоти на 15-20 с і більше (до 1 доби) в залежності від ступеня лужності. Після промивання виробляють імпрегнацію.
Гарне виявлення в зрізах волокнистих структур (колагенові, ретикулярні, нервові волокна) означає, що для даного матеріалу умови імпрегнації занадто «лужні». Цього можна уникнути: а) зменшенням часу імпрегнаціі- б) розведенням розчину нітрату серебра- в) зменшенням лужності розчину нітрату срібла (див. Вище) - г) заміною нейтрального формаліну кіслим- д) збільшенням концентрації кислого формаліну до 20%.