Приготування зрізів з парафінових блоків - основи гістології

різання

Наклеєний на дерев`яну колодку парафіновий блок міцно закріплюють у затиску мікротома, розташувавши довгою віссю паралельно довжині мікротома. Потім, встановивши необхідний кут різання і правильний кут нахилу ножа, його міцно закріплюють гвинтовими зажимами і розташовують над блоком.

Рис: 74.
Техніка різання парафінових блоків.

Після цього, регулюючи гвинтами механізм подачі, блок встановлюють таким чином, щоб верхня його площина була в горизонтальному положенні і не доходила до леза ножа на 0,5-1 мм. Коли попередня підгонка блоку до ножа закінчена, встановлюють Мікрометричними шкалу на отримання товстих (25-30 мкм) зрізів і рухом ножових санчат починають подавати блок вгору до отримання з нього перших повних зрізів. Потім проводять моделювання блоку: зрізають скальпелем надлишковий парафін, залишаючи навколо залитого об`єкта шар не більше 2-3 мм, і надають блоку прямокутну форму. Після цього встановлюють Мікрометричними шкалу на потрібну товщину зрізу і приступають до остаточної різанні матеріалу.
Слід пам`ятати, що переміщення ножових санчат уздовж рейкового шляху потрібно виконувати плавно і без зайвих зусиль. Не можна натискати на рукоятку зверху, так як це призводить до витіснення шару масла, що знаходиться між ковзними поверхнями, і опускання ножа, внаслідок чого зрізи виходять нерівномірними. Рух мікротомних ножем в момент проходження над блоком треба робити швидко.
Навчаються лаборантам краще починати з приготування гістологічних зрізів товщиною 14-16 мкм і лише поступово, у міру освоєння техніки різання, зменшувати товщину зрізів.
Правильно залиті невеликі шматочки органів і тканин при оптимальному температурному режимі в приміщенні ріжуться добре, і зріз, як правило, лягає на ніж в розправленому стані (кут різання прямий). При різанні великих блоків і твердого матеріалу зрізи часто
закручуються. Однак цього можна уникнути шляхом притримування і підведення зрізу пензликом за передній його край в процесі різання (рис. 74). Потрібно стежити, щоб зріз ні притиснутий до ножа, так як при цьому відбувається його приклеювання і пошкодження. Готовий зріз обережно знімають з ножа вологим пензликом (в напрямку від спинки до леза) і переносять або на підготовлене предметне скло, або в чашку з теплою (35-40 ° С) дистильованою водою. Воду попередньо кип`ятять, щоб попередити появу на нижній поверхні зрізів бульбашок повітря (який може бути розчинений у воді), що заважають рівномірному приклеюванню зрізів до скла. Поміщають зрізи на воду (предметне скло) обов`язково поверхнею, прилеглої до ножа, визначити яку можна по характерному блиску (верхня сторона завжди матова).

Мал. 75.
Порядок розташування серійних зрізів на склі.
При різанні треба стежити, щоб волоски від пензлика не потрапляли під ріжучий край ножа, так як це призводить до пошкодження леза.
Для ряду досліджень необхідно отримання серійних зрізів. Дуже важливо не переплутати черговість серійних зрізів при наклеюванні на предметне скло. Для цього стрічку зрізів розрізають скальпелем на окремі фрагменти довжиною близько 3/4 предметного скла і укладають завжди в певному порядку вздовж або поперек скла (рис. 75). Залежно від величини об`єкту і розміру предметного скла на одному склі може розміститися різну кількість зрізів (від 2-4 до 25-30).

Можливі похибки при виготовленні парафінових зрізів

Для того щоб отримати хороші гістологічні зрізи, необхідно вміти вчасно розпізнати і усунути причину, яка погіршує якість зрізів.

1. Зріз кришиться. Причини: 1) твердий парафін- 2) низька температура навколишнього середовища-3) повільне охолодження парафіну при залівке- 4) великий кут нахилу ножа. Усунення: 1) перезаліть матеріал в більш м`який парафін після попереднього розтоплення блоку в термостате- 2) дихати на поверхню блоку (зігрівання) перед кожним рухом ножа або пристосувати над блоком електричну лампочку- 3) змінити кут нахилу ножа.
2. Залитий матеріал в процесі різання випадає з навколишнього маси парафіну. Причини: 1) при перенесенні шматочка в формочку для заливки відбулося його охлажденіе- 2) заливка проведена охолодженим парафіном- 3) недостатнє видалення спирту перед просочуванням. Усунення: в першому і другому випадках необхідно блок розтопити в термостаті і залити заново, строго дотримуючись правил заливки, в третьому випадку після попереднього розтоплення матеріал переносять в проміжні середовища (для видалення спирту), потім знову просочують і заливають.
3. Площина зрізу нерівна, матеріал погано ріжеться або зовсім не ріжеться, ніж підскакує над поверхнею блоку. Причина - переуплотнение матеріалу при проводці і фіксації. Усунення неможливо. Можна лише кілька розм`якшити матеріал, якщо на поверхню різання перед кожним рухом ножа наносити пензликом шар гарячого парафіну (давши йому потім охолонути) або дихати на поверхню блоку.
4. Зрізи закручуються, прилипають до поверхні ножа, мнуться. Причини: 1) малий кут нахилу ножа- 2) м`який парафін- 3) висока температура навколишнього середовища. Усунення: 1) змінити кут наклона- 2 і 3) перезаліть матеріал в більш твердий парафін або охолодити блок шляхом приміщення перед різкою в холодильник (можна також покласти на поверхню різання шматочок льоду).
5. Приклеювання, зморщування або розрив зрізів, особливо при різанні органів, багатих кісткової, хрящової або щільною сполучною тканиною, можуть бути наслідком їх електризації. Усунення: поміщати на лезо (в місці проходження зрізу) краплю води, дихати на лезо і блок, натирати ділянку леза і прилеглу частину ножа шматком твердого парафіну.
6. Зрізи розриваються або покриті борознами. Причини: 1) щербини на лезі ножа- 2) брудний парафін (щільні смітинки дряпають зріз і псують лезо) - 3) матеріал погано декальцінірованний. Усунення: 1) точка і правка ножа або переміщення в ножедержателе- 2) перезаливка в чистий парафін- 3) усунути не можна.
7. Площина зрізу не однорідна (білувата в середній частині). Причина - недостатнє зневоднення. Усунення: розплавлення блоку і проведення матеріалу через проміжні середовища до абсолютного спирту. Після зневоднення проводять через проміжну середу, просочують і заливають.

Наклеювання.

Для того щоб парафінові зрізи можна було піддати подальшій обробці, їх необхідно наклеїти на предметне скло в розправленому положенні. Існує кілька методів наклеювання зрізів, але найбільш широко поширене приклеювання за допомогою білка з гліцерином.

Приготування розчину.

До білку зі свіжого курячого яйця додають рівну за обсягом кількість хімічно чистого гліцерину і добре збовтують (або збивають). Приготований розчин фільтрують через вологий складчастий паперовий фільтр в чистий флакончик. Щоб уникнути гниття білка до фільтрату додають 2-3 маленьких шматочка (з пшеничне зерно) тимолу або формалін (1: 100). В добре закритій посудині розчин зберігається тривалий час.

Мал. 76.
Натягування знаходяться на воді парафінових зрізів на предметне скло.

Підготовку предметних стекол до наклеювання слід зробити до початку різання парафинового блоку на мікротому, помістивши на ретельно очищену поверхню (див. С.146) скляною паличкою невелику краплю розчину білка з гліцерином і розтерши її до отримання рівномірного шару. Розтирання можна робити пальцем (попередньо протерши його ваткою, змоченою ефіром) або тонкої чистої лляної ганчірочкою. Приготувавши предметні скельця, приступають до різання парафинового блоку (див. Вище).
Існує кілька способів расправления і наклеювання зрізів.

1. Якщо зрізи були перенесені для розправлення в теплу воду, то змащене білком з гліцерином предметне скло підводять в похилому положенні під плаваючі зрізи, натягують їх на скло за допомогою пензлика або препаровальной голки (рис. 76) і надають їм правильне положення. Зрізи слід розташовувати кілька ексцентрично, щоб один кінець предметного скла був вільніший (при такому розміщенні залишається більше місця для нанесення позначень і потрібна менша кількість реактивів при обробці стекол в стаканчиках). Потім видаляють зайву воду (нахиливши скло і обережно притримуючи зрізи за парафінову облямівку), кладуть скла на планшети і поміщають в термостат або сушильну шафу (при 42-45 ° С) на 24 год, де і відбувається остаточне висушування та приклеювання зрізів. Можна висушувати і при кімнатній температурі, оберігаючи при цьому зрізи від запилення, але тоді краще витримувати їх 36-48 год.
2. Якщо зрізи перенесені з ножа безпосередньо на змащене білком з гліцерином предметне скло, то їх можна наклеювати по-різному.

Вологий спосіб. На скло за допомогою піпетки наносять кілька крапель кип`яченої дистильованої води і отримують плаваючі зрізи. Потім скло обережно підігрівають над спиртівкою і домагаються повного розправлення зрізів. При цьому слід уникати перегрівання, так як розплавлення парафіну призводить до пошкодження зрізу.
При певному навику ступінь нагріву досить легко визначити, прикладаючи нижню поверхню скла до тильної поверхні кисті (температура скла не повинна викликати відчуття печіння). Для цього способу расправления промисловість випускає спеціальні електричні прилади «Пристосування для сушки і розправлення парафінових зрізів» (ТУ 64-1-38-73).
Значна робоча поверхня приладу (250 x375 мм) дозволяє розташовувати на столику одночасно до 45 стекол. Прилад живиться від мережі змінного струму (напруга 127 або 220 В). Столик ставлять поруч з мікротомів. Перед початком різання знімають кришку, включають прилад в мережу. На покриті білком предметні скельця наносять кілька крапель дистильованої води, кладуть на столик. Зроблений зріз пензликом переносять на скло. Після його розправлення видаляють зайву воду, знову кладуть скло на столик до висихання, після чого скло зі зрізом перекладають на стіл і захищають від пилу до забарвлення.
Сухий спосіб. Плоскою (не дуже м`якою) пензликом притискають один край зрізу до предметного скла, потім обережно проводять по всьому зрізу, розправляючи і розкручуючи його. Після цього зріз притискають пензликом до скла так, щоб між його нижньою поверхнею і склом не залишалося бульбашок повітря, і швидко підігрівають над слабким полум`ям спиртівки (не перегрівати!). В результаті коагуляції білка зріз міцно приклеюється до предметного скла і може бути відразу підданий подальшій обробці без підсушування.
Недолік сухого наклеювання в тому, що тонкі і ніжні зрізи легко пошкоджуються і погано розправляються, тому воно може бути застосовано далеко не завжди.
У тих випадках, коли небажано наявність белковогліцерінового шару, зрізи можна наклеювати за допомогою дистильованої води або 30% спирту. При цьому способі предметні скельця повинні бути знежирені особливо ретельно, тому що в противному випадку вода нерівномірно розподілиться по склу та зріз погано приклеїться. Спосіб наклеювання досить простий: на скло наносять воду (або 30% спирт) і на неї кладуть зрізи блискучою стороною кнізу- потім нагрівають, розправляють, видаляють воду і сушать, як описано вище.
Якість приклеювання зрізів визначають, розглядаючи їх з боку скла, яке тримають в похилому положенні. Якщо зрізи здаються матовими, то приклеювання хороше, якщо є ділянки, відсвічують, як дзеркало, то між зрізом і склом знаходиться шар повітря і в цьому місці приклеювання не відбулося. Такі зрізи при подальшій обробці легко зісковзують з скла. Зазвичай повітряний прошарок з`являється при недостатній чистоті предметного скла або занадто низькій температурі сушильного шафи. Запобігти зісковзування таких зрізів можна шляхом целлоідіновой захисту.
Примітка. Перебування зрізів в теплій воді необхідно скоротити до мінімуму, так як інакше можуть статися набухання сполучної тканини (особливо при фіксації в рідинах, що містять трихлоруксусную і пикриновую кислоти), розчинення і вимивання деяких речовин, що входять до складу тканин.