Виявлення нервових елементів методом прижиттєвого фарбування метиленовим синім - основи гістології

Фіксацію матеріалу виробляють після фарбування, тому всі робочі розчини як для фарбування, так і для фіксації повинні бути приготовлені заздалегідь.

робочі розчини

Перш за все готують концентрований 1% розчин метиленового синього. У 100 мл рідини Рінгера - Локка розчиняють 1 г метиленового синього. Розчин можна зберігати тривалий час. Для фарбування його розводять рідиною Рінгера-Локка в кілька разів.
Рідина Рінгера - Локка подібно ізотоніче9кому розчину хлориду натрію включає речовини, що містяться в тканинах тварин. При роботі з ссавцями можна вживати рідину Рінгера - Локка наступного складу.

Якщо є відповідне обладнання, то рідина Рінгера - Локка перед досвідом можна наситити киснем, що покращує прижиттєве фарбування нервових елементів.
Для приготування розчину барвника необхідно користуватися хімічно чистим кристалічним метиленовим синім, що представляє собою подвійну хлорцінковую сіль, або ж вживати медичний хімічно чистий метиленовийсиній, позбавлений хлориду цинку.
Для фіксації матеріалу вживають розчини пікрату амонію або молібдату амонію. Вживають тільки кристалічний молибдат амонію (5-7 г цієї солі розчиняють в 100мл дистильованої води, після чого розчин фільтрують).
Пікрати амонію розчиняють в кількості приблизно 1 г на 100 мл підігрітої (до 60 ° С) дистильованої води. Готувати розчин треба безпосередньо перед досвідом. Використовують тільки червоний ізомер цієї солі. Для цього 25% розчин аміаку нагрівають на водяній бані (в витяжній шафі!) І потім невеликими порціями додають кристалічну пикриновую кислоту до тих пір, поки розчин не стане насиченим (т. Е. Поки розчинення не припиниться). При подальшому нагріванні на поверхні розчину з`являється тонка плівка з дрібних кристалів. Після цього нагрівання припиняють. Охолодження треба проводити повільно (на водяній бані або закутати колбу рушником). Через 12 год зливають рідину, а утворилися кристали пікрату амонію відразу ж розчиняють в дистильованої воді до отримання насиченого розчину (з сухим пікратом амонію треба звертатися дуже обережно, так як при сильному струшуванні і нагріванні може статися вибух). Дистильовану воду додають з таким розрахунком, щоб на дні залишалася достатня кількість кристалів, т. Е. Розчин був насиченим. Перед вживанням обидва розчини охолоджують до 3-5 С. За використанні розчину знову додають дистильовану воду до насичення.

фарбування

Наводимо методику, розроблену А. С. Догелем. Є різні способи введення барвника в орган, нервові елементи якого передбачається виявити. Розчин метиленового синього вводять через кровоносні судини або ж вирізаний з організму орган безпосередньо поміщають в розчин барвника. Існують і інші способи: в порожнину тіла (грудну, черевну) роблять ін`єкцію барвника, при якій перш за все фарбуються нервові елементи серозних оболонок, а потім (коли метиленовийсиній надійде в кров) і інших органів. Барвник вводять безпосередньо в тканину досліджуваного органу. Двома першими методами користуються частіше.
Приспавши тварина за допомогою наркозу, необхідно оголити великий артеріальна судина, найближчий до того органу, нервові елементи якого фарбують. Наприклад, якщо потрібно виявити нервові елементи нижньої кінцівки, оголюють черевну аорту трохи вище її біфуркації, при ін`єкції області голови - сонну артерію на шиї і т. Д. У дрібних тварин (щури, морські свинки, кроленята, кошенята) канюлю вставляють безпосередньо в аорту . Посудина беруть на лігатуру біля місця ін`єкції (ближче до серця) і перев`язують. Надрізавши посудину, вставляють в нього канюлю відповідного розміру і зміцнюють її лигатурой. Гумовою трубкою (забезпеченою затискачем) канюлю з`єднують з посудиною, в який налита рідина Рінгель-Локка, нагріта до температури 37 ° С. Перед тим як ввести канюлю, необхідно, користуючись затискачем, заповнити рідиною всю трубку і канюлю. Посудина з рідиною Рінгера - Локка зміцнюють приблизно на 70 см вище рівня канюлі, відкривають затискач і пропускають в посудину промивну рідину. Якщо таку установку для промивання (і подальшого введення барвника) зібрати не можна, то розчин Рінгера - Локка і метиленовийсиній можна вводити в посудину шприцом, з`єднавши його гумовою трубкою з канюлею.
Таким чином після промивання ін`єктують і розчин метиленового синього, підігрітий до температури тіла тварини (з розрахунку 15 мл 1% розчину метиленового синього на 1 л рідини Рінгера - Локка). Час ін`єкції барвника треба визначити дослідним шляхом. Для цього шматочки тканини з ін`єктується області затискають між двома предметними скельцями і при слабкому збільшенні мікроскопа контролюють хід забарвлення нервових елементів. Зазвичай час забарвлення не перевищує 40-50 хв. Після того як ін`єкція закінчена, орган розкривають і протягом 2-3 хв залишають на повітрі (в присутності кисню забарвлення нервових елементів посилюється).
Потім невеликі шматочки органу вирізають і поміщають в термостат при температурі 37 ° С для докрашіванія. Для цієї мети на дно чашки поміщають фільтрувальний папір, змочений тим же розчином барвника, який застосовували для ін`єкції, і на поверхню об`єкта по краплях наносять розчин барвника. Затиснувши невеликий шматочок органу між двома предметними скельцями, контролюють хід фарбування під мікроскопом.
Можна проводити фарбування шляхом занурення органу в барвник. Цей спосіб частіше застосовують при роботі з тонкими органами, такими, як стінки порожнистих внутрішніх органів. Шматочок органу вирізують, розправляють, поміщають | в чашку Петрі на фільтрувальний папір, а потім заливають розчином метиленового синього в рідини Рінгера - Локка. Також проводять контроль ходу фарбування під мікроскопом.

Фіксація і висновок

Після фарбування метиленовим синім потрібно негайно фіксувати об`єкт, тому важливо заздалегідь приготувати і охолодити фіксуючу рідину. Фіксацію проводять при температурі 1-3 ° С. Час фіксації залежить від величини об`єкта. Для тонких плівок час фіксації розчином молібдату амонію складає 30 хв - 1 год, розчином пікрату амонію - 2-3 ч. Більш товсті об`єкти фіксують 12-24 год.
У деяких випадках вживають подвійну фіксацію: протягом 30-40 хв фіксують розчином пікрату амонію, а потім на 1 добу переносять в розчин молібдату амонію.
Після фіксації необхідно ретельно промити шматочки в дистильованої воді, яку змінюють 5-6 разів, щоб видалити кристали фіксують солей. Потім їх швидко проводять через 96 ° і абсолютний спирт, ксилол і укладають в бальзам. Якщо необхідно приготувати зрізи, то заливають в целлоидин. Парафінова заливка можлива тільки при описаної вище послідовної фіксації обома солями. Плівчасті препарати і зрізи можна докрасіть будь-яким ядерним барвником, наприклад галуновим карміном. Пофарбовані в синій колір нервові елементи чітко видно на тлі навколишніх клітин, ядра яких пофарбовані в червоний колір.
Освоєння методики суправітально фарбування метиленовим синім також краще починати з таких об`єктів, в яких виявлення нервових елементів найбільш просто і демонстративно.
Для цієї мети можна рекомендувати нервові вузли кишкової сменки лабораторних тварин (найкраще вдається фарбування нервових елементів молодих кішок і собак).