Методи фарбування препаратів - основи гістології
Відео: Техніка фарбування препаратів в дерматології
Фарбування гематоксилін-еозином (фіксація будь-яка)
Цей метод найпоширеніший в гістологічної практиці, так як завдяки вдалому поєднанню барвників, що відносяться до двох протилежних груп, дозволяє отримати загальне уявлення про стан досліджуваних органів і тканин.
Гематоксилін - природний барвник рослинного походження, розчинний у воді, спирті і гліцерині *.
Відео: Автоматичний апарат для фарбування Leica ST5010 XL
* Остання обставина є протипоказанням до висновку в гліцерин зрізів, забарвлених гематоксиліном.
У розчині гематоксилин володіє основними властивостями, завдяки чому добре виявляє структурні компоненти ядра, які містять нуклеїнові кислоти. Однак барвником властивістю володіє не сам гематоксилин, а продукт його окиснення -гематеін.
Еозин - штучний барвник, розчинний у воді або спиртах, володіє кислотними властивостями, забарвлює цитоплазму клітин в рожевий колір.
Існують численні способи приготування фарбувальних розчинів з гематоксиліном, але суть їх одна - його окислення.
Наводимо найбільш поширені рецепти.
Кислий гематоксилин Ерліха. У 100 мл 96% спирту розчинити 2 г гематоксиліном, додати 100 мл дистильованої води, потім 100 мл чистого гліцерину, 3 г калійних квасцов (хімічно чистих) і 10 мл крижаної оцтової кислоти, збовтати і залишити на світлі «дозрівати» протягом 14 днів , періодично збовтуючи. Для того щоб забезпечити постійний доступ повітря (процес окислення гематоксиліном), слід брати шірокогорлую посудину і накривати вхідний отвір декількома шарами марлі. У процесі «дозрівання» розчин з світло-червоного стає темно-червоним. У щільно закритій посудині барвник зберігає властивості тривалий час.
Гематоксилін Бемера. У 10 мл 100% спирту розчинити 1 г кристалічного гематоксиліном і додати 200 мл 10% водного охолодженого і профільтрованого розчину калійних квасцов. Розчин «дозріває» на світлі протягом 4-5 днів, після чого їм можна користуватися. Перед вживанням розчин барвника кожен раз фільтрують. Згодом він псується.
Кислий гемалаун Майера. У 1000 мол дистильованої води розчинити 1 г гематоксиліном, додати 0,2 г йодату натрію (NaIО3), 50 г калійних квасцов (хімічно чистих) і, безперервно помішуючи, дочекатися їх повного розчинення (при цьому рідина набуває фіолетово-синє забарвлення). Потім додають 50 г хлоралгідрату і 1 г кристалічної лимонної кислоти, в результаті чого розчин стає фіолетово-червоним. В добре закритій посудині з хімічно чистого скла барвник зберігається тривалий час.
Перевага даного методу - швидке окислення гематоксиліном йодатом натрію, завдяки чому розчин не вимагає «дозрівання» і відразу може вживатися для фарбування.
Приготування фарбувального розчину з гематеіна: а) 1г фабричного гематеіна розчиняють в 50 мл 96% спирту (при слабкому підігріванні) - б) 5 г калійних квасцов (хімічно чистих) розчиняють в 1 л дистильованої води. Потім зливають обидва розчини, фільтрують і додають трохи тимолу (для консервації). Застосовують без «дозрівання». Розчин добре зберігається в щільно закритій посудині.
Приготування еозину: 0,1 барвника розчиняють в 100мл дистильованої води.
Перед фарбуванням необхідно підготувати робоче місце, прибрати в сторону всі зайві предмети, встановити мікроскоп і освітлення до нього, розставити в певному порядку посуд з відповідними рідинами, перевірити стан «батарей» для зневоднення і просвітлення препаратів, відфільтрувати фарбувальні розчини, підготувати покривні (а якщо потрібно, і предметні) скла і т. д. Лише після цього можна приступати до фарбування препаратів.
Методика фарбування. Починати слід з визначення тривалості, так як вона знаходиться в залежності від способу фіксації, характеру і властивостей препарату і самих барвників і т. Д. Для цього беруть із дистильованої води три скла зі зрізами (доведення препаратів до води - див. Попередній розділ), видаляють надлишки вологи навколо них (інакше фарба розтечеться по всьому склу та розбавиться водою), кладуть у горизонтальному положенні і накапують піпеткою розчин барвника до повного покриття препарату. Через 2 хв зливають фарбувальний розчин * з одного з стекол і поміщають його в дистильовану воду (для відмивання надлишків барвника). Два залишилися скла звільняють від гематоксиліном через 4-6 хв відповідно. Після цього, витерши тильну сторону скла, препарат розглядають при малому збільшенні мікроскопа (якщо потрібно, то і при великому, накривши препарат покривним склом). При фарбуванні свободноплавающих зрізів за допомогою гачків переносять кілька зрізів в барвник, налитий на годинне скло або в низький бюкс, а потім через такі ж проміжки часу витягають, промивають в дистильованої воді, розправляють на чистому предметному склі і розглядають під мікроскопом.
Можливі варіанти результатів: а) ядра пофарбовані в світло-фіолетовий колір без чіткого відмінності мікроструктур - препарат недокраш е н-б) ядра темно-фіолетові (майже чорні, але з червонуватим відтінком), структурні елементи розпливчасті, цитоплазма теж пофарбована - препарат перекрашен- в) ядра червоно-фіолетові з чітко вираженими ядерцем і хроматином, цитоплазма світла, непофарбована - забарвлення нормальна.
* Барвник зливають в посудину, звідки його брали, так як він придатний до подальшого вживання.
Встановивши оптимальний час фарбування гематоксиліном, протягом 3-5 хв відмивають надлишки барвника в дистильованої воді і потім поміщають препарати в водопровідну воду, де вони знаходяться до придбання синього забарвлення (10-14 хв) внаслідок посиніння ядер в слабощелочной середовищі (водопровідну воду можна замінити дистильованої, злегка подщелочив її аміаком). Після цього препарат знову поміщають на 3-5 хв в дистильовану воду.
Крім викладеного вище прогресивного методу забарвлення ядер гематоксиліном, існує регресивний метод. Зріз з перефарбованими ядрами після промивання в дистильованій воді поміщають на 1-6 с в підкислений 70 ° спирт (5-7 крапель міцної соляної кислоти на 100 мл спирту) і під контролем мікроскопа стежать за ослабленням забарвлення (слабшає фіолетовий і посилюється червонуватий тон ядер) . Подальша обробка звичайна.
Забарвлення ядер гематеіном і кислим гемалауном Майера виробляють таким же способом, але необхідно особливо ретельно промити препарат, так як неудаленія залишок кислоти може порушити забарвлення.
Після закінчення промивання пофарбованого гематоксилином препарату в дистильованої воді його знову витягають, видаляють зайву вологу і накапують розчин еозину. Час забарвлення також підбирають дослідним шляхом, варіюючи експозицію від 1 до 4-5 хв.
Можливі варіанти: а) пофарбована цитоплазма і позаклітинні освіти мають ледь помітний рожевий або жовтуватий відтінок - препарат недокрашен- б) загальний фон інтенсивно червоного кольору, мікроструктури видно нечітко, межа ядер розпливчаста - препарат перекрашен- в) загальний фон помірно рожево-жовтого кольору, ядра чітко контурируются - забарвлення вдала.
Після того як фарбування еозином закінчено, барвник зливають назад у флакон (як і гематоксилін, він може вживатися багаторазово), препарат обполіскують в дистильованої воді, проводять через спирти висхідної концентрації, карбол-ксилол, ксилол і укладають в бальзам.
Слід знати, що еозин легко вимивається в воді і спиртах низької концентрації, тому проводити препарат через ці рідини слід швидко, лише зануривши кілька раз, і тільки в 96% і 100% спирті можна тримати 1-2 хв. Якщо препарат перефарбований еозином, то зайву забарвлення слід видалити, збільшивши час промивання (в дистильованої воді) і проведення через слабкі спирти.
Для посилення фарбувальних властивостей еозину застосовують підкислення розчину барвника оцтовою кислотою (1 крапля 3% оцтової кислоти на 100 мл барвника).
Крім описаного подвійного методу оглядової забарвлення препаратів, застосовуються і інші.
Існують барвники, фарбують ядра в червоний колір (сафранін, квасцовий кармін), а цитоплазму - в зелений (світловий зелений), помаранчевий (помаранчевий Г).
Фарбування залізним гематоксиліном по Гейденгайну
(Фіксація будь-яка, але найкращі результати після сулемового і хромових фіксаторів)
Залізний гематоксилін на відміну від наведених вище гематоксилінових розчинів забарвлює не тільки ядра, але і різні цитоплазматичні і деякі міжклітинні структури. Це властивість грунтується на тому, що перед фарбуванням препарат протруюють в розчині железоаммоніевие квасцов, які по-різному сприймаються різними тканинними елементами. Подальша обробка протравлених тканин гематоксилінові розчином призводить до утворення чорного залізно-гематеінового лаку, який в процесі диференціювання зрізів частково йде з тканин назад в розчин. Таким чином, по типу фарбування залізний гематоксилін - типовий регресивний барвник.
Зі сказаного випливає, що, варіюючи час протруювання, фарбування і диференціювання, можна отримувати різний кінцевий ефект в залежності від цілей дослідження (виявити тільки ядерні структури або одночасно цитоплазматические і позаклітинні освіти).
Приготування розчинів. 1. Розчин железоаммоніевие квасцов. Розчинити 10 г железоаммоніевие квасцов (сульфат аміаку-заліза) в 100мл дистильованої води. Можна вживати тільки світло-фіолетові кристали. Жовті, зелені, білуваті кристали застосовувати не слід.
- Розчин гематоксиліном. Розчинити 1 г гематоксиліном в 10 мл 96% спирту і розбавити дистильованою водою до 100 мл, зазначивши рівень рідини в посудині, потім залишити для «дозрівання» на 4-5 тижнів, забезпечивши постійний доступ світла і повітря (для цього шийку посудини треба прикрити складеної в кілька шарів марлею і в міру випаровування доливати воду до початкового рівня). В процесі дозрівання розчин змінює світло-коричневе забарвлення на темно-коричневу. Перед вживанням розчин розбавляють рівною кількістю дистильованої води.
Якщо потрібно забезпечити швидке приготування розчину гематоксилін (без дозрівання), то до розчину, приготовленого за описаним вище рецептом, додають 0,1 г йодату натрію (NaIО3), який швидко окисляє гематоксилин в гематеін і робить барвник придатним до вживання через 1 год після приготування .
Проведення фарбування. Попередня обробка. Знаходяться в дистильованої воді зрізи переносять в 2,5% розчин железоаммоніевие квасцов (приготований шляхом розведення дистильованою водою вихідного 10% розчину) і залишають на 3-12 год.
Процес протруєння можна значно прискорити (до 1-3 хв), помістивши посудину зі зрізами в термостат при 37 ° С. Після закінчення протруювання розчин зберігають.
Фарбування. Після ополіскування в дистильованої воді зрізи поміщають в розбавлений (вдвічі) розчин гематоксиліном на 1-36 год, до повного почорніння (краще перефарбувати, ніж недокрасіть). Як і при протравливании, час фарбування можна скоротити (до 2-3 ч - 30 хв) шляхом приміщення посудини з фарбувальними зрізами в термостат при 37 ° С.
Диференціація. Це найвідповідальніший етап фарбування. Пофарбовані зрізи ретельно відмивають в двох-трьох порціях дистильованої води (7- 10 хв) і поміщають в розчин железоаммоніевие квасцов, служив для протруювання. Ступінь диференціювання періодично контролюють в мікроскоп. Для цього зріз споліскують в дистильованої воді і розглядають при потрібному збільшенні (аж до водної іммерсіі накривши попередньо покривним склом). Якщо процес диференціювання йде швидко, то слід зменшити концентрацію розчину железоаммоніевие квасцов, розбавивши його дистильованою водою.
Отримавши забарвлення потрібного ступеня, зрізи ретельно промивають в проточній або часто замінної водопровідній воді протягом 10-12 хв (недостатнє відмивання диференціює рідини призводить до знебарвлення препаратів) та промивати в дистильованої воді, зневоднюють, просвітлюють і укладають в бальзам.
Швидкий метод фарбування залізним гематоксиліном по Гурвич
У разі необхідності термінового фарбування зрізів залізним гематоксиліном Гейденгайна застосовують у Скореня метод Гурвича (реактиви ті ж).
Вийнявши скло зі зрізами з дистильованої води, промокають зріз гладкий фільтрувальної папером і покривають 2,5% розчином железоаммоніевие квасцов. Потім тильну сторону скла підігрівають над спиртівкою до освіти пара (не перегрівати!) І, давши трохи охолонути, повторюють процедуру нагрівання ще 2-3 рази. Після цього зливають галун, що не промиваючи зріз, накапують гематоксилин і знову підігрівають до появи парів. Забарвлення ведуть до тих пір, поки зріз не набуває синьо-чорний колір. Потім його промивають в дистильованої воді, заливають квасцами і стежать за ходом диференціювання в мікроскоп. Після закінчення диференціювання зріз ретельно відмивають від квасцов (в двох-трьох змінах дистильованої води, а потім у проточній), зневоднюють, просвітлюють і укладають в бальзам. При роботі зі свободноплавающими зрізами рекомендується попередньо наклеїти їх на предметне скло відразу ж по витягу з води і вести забарвлення, як описано. Обробка зрізів в свободноплавающей стані може дати нерівномірне забарвлення.
Загальні зауваження. Наведене вище опис протруювання, забарвлення і диференціювання залежить від багатьох факторів (якість реактивів, властивість досліджуваного об`єкта, мети і завдання дослідження і т. Д.) І встановлюється дослідним шляхом в кожному конкретному випадку. Найбільш відповідальним етапом фарбування є диференціювання, так як окремі структурні компоненти клітин і тканин з різною швидкістю віддають назад накопичений барвник. Швидше за всіх знебарвлюється гомогенна частина цитоплазми, потім її гранулярні компоненти і в останню чергу структурні елементи ядра.
При роботі з целлоідіновимі зрізами слід попередньо звільнити препарат від целлоидин (див. Відповідний розділ), так як він значно підфарбовується залізним гематоксиліном і не знебарвлюється при диференціювання. Розчинення целлоидин слід виробляти до протруювання в железоаммоніевие квасцах, так як після нього розчинність значно погіршується.
Етикетування предметних стекол
Після наклейки зрізів (або безпосередньо перед нею) на предметне скло необхідно нанести відповідні позначення. Особливо це важливо при серійних зрізах і при обробці експериментального матеріалу. Конкретний зміст позначок залежить від характеру дослідження і від установок, прийнятих в тій чи іншій лабораторії. Найбільш надійний спосіб - видряпування знаків спеціальними олівцями з наконечниками з твердих сплавів типу «переможе». Менш надійні написи тушшю. Існують різні прийоми, щоб туш при обробці в рідких середовищах змивалася і не розмазувалася: а) до наклеювання зрізів один з кінців предметного скла, змащений білком з гліцерином, нагрівають над вогнем до появи диму, після охолодження наносять на дану ділянку необхідні позначення і знову прогрівають над пламенем- б) наносять відповідний напис, а потім опускають цю частину скла в 1-2% розчин целлоидин для утворення захисної плівки і т. д.
