Гістохімічні методи - основи гістології

Відео: ТОВСТА КИШКА. LARGE INTESTINE. У світловий мікроскоп

Тривалий час для вивчення хімічного складу клітин і тканин користувалися виключно класичними біохімічними методами, в основі яких лежить сумарне визначення хімічних речовин в подрібненої тканини (гомогенате). Однак, незважаючи на свої позитивні якості, ці методи не забезпечували повного уявлення про локалізацію тих чи інших хімічних речовин в різних структурних компонентах клітин і тканин. Пошуки методів, за допомогою яких можна було б визначати локалізацію хімічних речовин в цілісних мікроструктурах органів і тканин, привели до створення гистохимического методу, що об`єднує в собі гістологічний і біохімічний методи.
При гістохімічних реакціях неорганічні і органічні речовини, що входять до складу клітин, вступають в хімічну реакцію з різними реактивами (барвниками) і утворюють забарвлені продукти реакції. За ступенем інтенсивності цих продуктів можна до певної міри судити і про кількісний вміст хімічної речовини в тій чи іншій структурі. В основі більшості гистохимических реакцій лежать загальні принципи.

1. Певні хімічні угруповання фарбуються тим чи іншим барвником. Наприклад, фосфатні групи РНК утворюють з основними барвниками (піронін, толуїдиновий синій і ін.) Солеобразние забарвлені сполуки.
2. Барвник розчиняється в певному субстраті, що входить до складу клітинних структур. Наприклад, забарвлення жирових включень в клітці заснована на розчиненні Судану в жировій краплі.
3. Деякі хімічні компоненти клітин, такі, як ДНК, полісахариди, нездатні реагувати з барвниками. У таких випадках вдаються до перетворення їх хімічних угруповань в реакційно-активний стан (гідроліз ДНК хлористоводневою кислотою, окислення полісахаридів йодною кислотою). При цьому звільняються або створюються знову хімічні угруповання, які здатні реагувати з відповідними реактивами, в результаті чого утворюється забарвлений продукт реакції.
4. При виявленні локалізації деяких компонентів клітини вдаються до багатоступеневим проміжним реакцій і перекладу неокрашенного продукту реакції в пофарбований. Наприклад, так роблять при гістохімічному фарбуванні ферментів (докладніше про це див. Нижче).

Новий метод отримав широке поширення в дослідницькій практиці. В даний час жодна морфологічна лабораторія не обходиться без застосування гістохімічних методик. Однак успішне володіння ними вимагає засвоєння певних навичок і дотримання ряду умов, так як на відміну від гістологічних методик, що носять здебільшого емпіричний характер, гістохімічні засновані на певних хімічних механізмах і мають сувору специфічністю. Звідси головна вимога - особлива точність і ретельність в роботі. Критерієм в оцінці результатів гистохимической реакції є не тільки локалізація хімічних речовин, але і інтенсивність забарвлення досліджуваних компонентів клітин і тканин, так як саме вона свідчить про концентрацію виявляються речовин. Якщо при гістологічної обробки матеріалу можливі деякі відхилення в ході фарбування препарату, то прийоми, використовувані для підготовки матеріалу і проведення гістохімічних реакцій, повинні ретельно дотримуватися, бо відхилення на будь-якому етапі можуть змінити хід реакції і в кінцевому підсумку призвести до неправильної оцінки препарату.
Для створення належних умов протікання хімічних реакцій особливу увагу потрібно приділити приготуванню робочих розчинів, а також чистоті застосовуваної посуду і скла, якості реактивів і т. Д.
В даний час гистохимія перейшла на кількісний рівень дослідження із застосуванням спеціальних приладів (цитоспектрофотометрії), що дозволяють досить точно визначати кількісну характеристику інтенсивності забарвлення (продукту реакції), що особливо важливо для оцінки стану метаболізму в досліджуваних органах, тканинах і окремих клітинах. Це ще більшою мірою висуває підвищені вимоги до якості проведення гістохімічних реакцій і дотримання суворої стандартизації обробки порівнюваних об`єктів на всіх етапах. Саме з цією метою в першу чергу застосовують поєднання порівнюваних зразків в одному блоці з подальшим отриманням зрізів однакової товщини на одному склі (див. С. 178) .Коли це зробити неможливо, необхідно в ході різання розташовувати різні зрізи на одному предметному склі. При будь-якому способі поєднання порівнювані зрізи слід піддавати всіх етапах гистохимических реакцій одночасно, використовуючи одні й ті ж порції реактивів.

Буферні розчини і їх приготування

Хімічні процеси, що протікають в тканинах організму, особливо за участю ферментів, вимагають наявності ряду умов, серед яких важливе значення має pH середовища. Як відомо, ступінь кислотності даного розчину залежить від концентрації іонів Н +, а ступінь його лужності - від концентрації іонів ОН.
При певній температурі твір позитивно і негативно заряджених іонів - величина постійна. Знаючи один з показників, можна визначити інший. Виходячи з цього положення, в хімії прийнято позначати кислотність або лужність розчину умовно через водневий показник (pH), що представляє логарифм концентрації іонів Н +, узятий з оберненим знаком. Так, при pH 7,0 концентрація іонів Н + дорівнює концентрації іонів ОН" і розчин має нейтральну реакцію. Чим показник pH менше 7,0, тим концентрація іонів Н + вище (адже показник з протилежним знаком) і тим більше кислотність розчину. Навпаки, чим pH більше 7,0, тим менше іонів Н + в розчині і більш виражені його лужні властивості.
Різні ферменти вимагають для прояву своєї активності різних значень pH. Так, оптимальне умова для дії лужноїфосфатази при pH 9,0, тоді як для кислої фосфатази потрібно pH 5,0.
Щоб забезпечити найкращі умови для прояву активності гистохимически виявляється ферменту, необхідно, щоб в середовищі інкубації підтримувалося значення pH, оптимальне для даного ферменту. Ця умова досягається введенням в середу інкубації буферних сумішей з заданими значеннями pH. Найбільш поширеними буферними розчинами є фосфатний, ацетатний і трис-буфер.

Приготування буферних розчинів

Перш ніж дати прописи буферних сумішей, необхідно нагадати, що для визначення концентрації розчинів реактивів прийняті поняття молярность (М) і нормальність (N).
Молярность розчину (М) - кількість грам-молей речовини, що містяться в 1 л розчину. Грам-моль - молекулярна маса даної речовини, виражена в грамах. Наприклад, для приготування розчину в концентрації 0,2 М необхідно на 1 л розчину взяти речовину в кількості, що дорівнює 0,2 його молекулярної маси.
Нормальність (N) - кількість грам-еквівалентів в 1 л розчину. Грам-еківалент-кількість даної речовини, хімічно рівноцінне в даній реакції 1 грам-атома водню. Тому:

Фосфатний буфер (pH 6,0-8,0). Розчини: А - 0,2 М КН2 РО4 (13,6 г солі в 1 л дистильованої води) - Б - 0,2 М Na2 НРО4 (31,2 г Na2 НРО4, 2Н2О в 1л дистильованої води).
Для отримання 100 мл буфера потрібного pH слід злити розчини А і Б в кількостях, зазначених у табл. 3.
Ацетатний буфер (pH 3,6-5,6). Розчини: А - 0,5N СН3 СООН (30 мл крижаної оцтової кислоти долити до 970 мл дистильованої води) - Б - 0,5NCH3 COONa (68 г солі розчинити в 1 л дистильованої води). Злити розчини А і Б в кількостях, зазначених у табл. 4.
Таблиця 3

Відео: СЕЧОВОЇ міхур гістологічну будову URINARY BLADDER

Таблиця 4

Тріс-буфер (pH 7,2 - 9,0). Розчини: А - 0,2 М трис (оксиметил) -амінометана (24,3 г солі в 1 л дистильованої води) - Б - 0,1N НС1.
Злити зазначені кількості розчинів А і Б і долити до 100 мл дистильованою водою (табл. 5).
Як вихідні розчини, так і самі буферні суміші можуть зберігатися тривалий час.
Таблиця 5

Примітка. Якщо потрібно приготувати буферний розчин інший молярности, ніж зазначено в цій інструкції, то слід змінити лише молярность вихідних розчинів, кількісні ж їх співвідношення для отримання pH залишаються незмінними.
Проте, щоб уникнути помилок (якість реактивів, неточність при складанні) pH приготованих буферних розчинів перед вживанням слід перевіряти. Груба перевірка може бути здійснена за допомогою індикаторного паперу, більш точна - за допомогою спеціального приладу-потенціометра (рН-метр).

Виявлення нуклеїнових кислот

Нуклеїнові кислоти (високомолекулярні сполуки складного хімічного складу) відіграють надзвичайно важливу роль в забезпеченні життєдіяльності будь-тваринної і рослинної клітини. Рибонуклеїнова кислота (РНК) здійснює синтез білків, а дезоксирибонуклеиновая (ДНК) - зберігання і передачу спадкових ознак. Перша міститься в цитоплазмі і ядерцях, друга - в хроматині ядер. Настільки важлива роль нуклеїнових кислот є причиною великого інтересу до вивчення їх змісту та поширення в органах і тканинах організму. Існує кілька способів гистохимического виявлення нуклеїнових кислот, але найбільшого поширення набув метод Браше (для виявлення РНК) і метод Фельгена (для виявлення ДНК).

Виявлення РНК за методом Браше

(Фіксатори можуть бути різні, але найкращі Карнуа, Бродського і Ценкера- заливка в парафін)
В даний час цей метод багато в чому втратив своє колишнє важливе значення в зв`язку з тим, що результат реакції не піддається кількісній оцінці на цитоспектрофотометрії. Разом з тим даний метод ще досить широко застосовується в лабораторіях (особливо, де немає цитоспектрофотометрії) і саме його освоєння дає навик лаборанту в приготуванні і очищення хімічних розчинів.
Суть методу полягає у виборчому приєднання деяких основних барвників до нуклеїнових кислот (при цьому методі - піроніном до РНК і метилового зеленого до ДНК).
Перш ніж приступити до гистохимической реакції, необхідно провести очищення металевого зеленого, так як наявний у продажу препарат завжди містить домішки метилового фіолетового, значно спотворює результат забарвлення. Для цього до водного розчину метилового зеленого додають хлороформ (або аміловий спирт) і, закривши посудину, енергійно струшують. Після того як суміш відстоїться, в ній чітко видно два шари - темний верхній, який представляє водний розчин барвника, і нижній фіолетовий - хлороформ, пофарбований метиловим фіолетовим. Злив обережно водний розчин, до нього знову додають хлороформ і повторюють всю процедуру. Відмивання виробляють до тих пір, поки хлороформ не перестане забарвлюватися в фіолетовий колір. Очищений і висушений препарат може зберігатися тривалий час.
робочі розчини
Розчин А: 5% водного розчину піроніном 17,5 мл, 2% водного розчину метилового зеленого 10 мл, води дистильованої 250 мл.
Розчин Б: 0,5 М ацетатний буфер з pH 4,8 (приготування див. С.265).
Перед вживанням зливають рівні об`єми розчинів А і Б (зберігати не більше тижня).
Метод. 1. Парафінові зрізи товщиною 5-7 мкм Депарафінірованние і довести до води.

1. Помістити в розчин метилового зеленого - піроніном (від 100 хв до 20 год).
2. Промити протягом декількох секунд в дистильованої воді (збільшення термінів промивання призводить до вимивання піроніном).
3. Висушити фільтрувальним папером.
4. Швидко провести через абсолютний ацетон, суміш з рівних частин ацетону і ксилолу, 10% розчин ацетону в ксилолі.
5. Просветлить в двох порціях ксилолу і укласти в бальзам.

Результат. РНК ядерець і цитоплазми яскраво червоного кольору, хроматин ядер зелений або синьо-зелений.
З метою перевірки специфічності фарбування на РНК ставлять паралельно контрольну гістохімічним реакцію. Для цього шляхом спеціальної обробки з зрізів видаляють РНК, після чого виробляють фарбування метиловим зеленим - піроніном за описаною вище схемою.
Результат. Забарвлення піроніном не відбувається, метиловим зеленим - ослаблена.
Найкращим способом видалення РНК є обробка зрізів ферментом рібонуклеазою (0,1-0,5 мг кристалічної рибонуклеази в 1 мл дистильованої води) протягом 2-3 год при 56 ° С.
При відсутності рибонуклеази можна зробити екстракцію РНК, поміщаючи зрізи в 10% розчин холодної хлорної кислоти (HCIO4) на 3-6 год.

Реакція галлоціаніна і хромових квасцов з нуклеїновими кислотами (РНК і ДНК) по Ейнарсону
(Фіксатори Бродського, Карнуа)
Даний метод на відміну від методу Браше більш простий, надійний і дозволяє кількісно оцінювати зміст нуклеїнових кислот за допомогою сучасних цитоспектрофотометрії, завдяки чому знайшов широке застосування.
Приготування розчину барвника
Розчинити 5 г хромових квасцов (придатні лише прозорі фіолетові кристали) в 100 мл дистильованої води. Додати 015 г галлоціаніна і змішати, струшуючи. Поступово нагріти і довести до кипіння. Кип`ятити 5 хв. Охолодити до кімнатної температури, профільтрувати і додати дистильованої води, доповнивши обсяг фільтрату до 100 мл. Перевірити pH (повинно бути 1,64),
Проведення реакції: довести зрізи або мазки до води. Фарбувати 48 год при кімнатній температурі. Швидко промити, збезводнити і укласти в бальзам.
Результат. Фарбуються РНК і ДНК. 11еет структур, що містять нуклеїнові кислоти, від яскраво-синього до сірого, в залежності від марки барвника. Для поділу РНК і ДНК використовувати нуклеази (див, метод Браше).

Виявлення ДНК за методом Фельгена

(Фіксатори різні, але найкращі Карнуа, Ценкера- заливка в парафін)
Суть методу полягає в тому, що продукти розщеплення молекули ДНК, що здійснюється в слабокислою середовищі, взаємодіючи з безбарвною фуксінсерністой кислотою (реактив Шиффа), утворює комплекс, що володіє пурпурової забарвленням. Таким чином, локалізація продукту гистохимической реакції вказує місцезнаходження ДНК, а інтенсивність забарвлення - її концентрацію.

реактив Шиффа. Розчиняють 1 г основного фуксину в 200 мл киплячої дистильованої води і, періодично струшуючи посудину з розчином, продовжують кип`ятіння протягом 5 хв. Потім охолодивши вміст до 50 ° С, розчин фільтрують, додають 20 мл 1N розчину НС1 і охолоджують до 25 ° С, після чого додають 1 г метабісульфіту натрію (Na2S2О 5) або калію (K2S2O5) і залишають в темряві. Через 18-24 год в розчин всипають 2 г активованого вугілля, струшують протягом 1 хв, фільтрують і зберігають у темному місці при 0-4 ° С. Готовий реактив Шиффа безбарвний або має світло-жовте забарвлення. Почервоніння розчину в процесі зберігання свідчить про його розкладанні і непридатності до вживання.
Необхідно мати на увазі, що іноді в продаж надходить недостатньо очищений основний фуксин. Тому якщо приготовлений розчин не відповідає поставленим вимогам, потрібно взяти основний фуксин з нової партії і знову приготувати реактив.
Однонормальним розчин хлористоводневої кислоти (1N). До 10 мл концентрованої хлористоводневої кислоти (щільність 1,19) додають 90 мл дистильованої води. Розчин може зберігатися тривалий час.
Серністокіслого вода для промивання зрізів. До 5 мл 10% бисульфита калію (K2S2O5) додають 5 мл 1N розчину НС1 і доливають дистильованою водою до 100 мл. Розчин бисульфита калію можна застосовувати протягом 7 днів, серністокіслого ж воду готують перед вживанням і застосовують одноразово.
Метод. 1. Парафінові зрізи товщиною 5-7 мкм Депарафінірованние і довести до води.

1. Швидко обполоснути в холодній IN НС1.
2. Помістити в IN НС1 при 60 ° С на 6 хв (стаканчик ставлять у водяну баню).
3. Швидко обполоснути в холодній IN НС1, а потім в дистильованої воді.
4. Помістити в реактив Шиффа на 40-60 хв.
5. Осушити фільтрувальної папером і обполоснути в трьох порціях свежеприготовленной серністокіслого води по 1-2 хв у кожній.
6. Промити у водопровідній воді до 10 хв (якщо потрібно докрасіть цитоплазму: зріз поміщають на 1-1,5 хв в 1% водний розчин світлого зеленого або 0,5% спиртовий розчин міцного зеленого).
7. Збезводнити, просветлить і укласти в бальзам. Результат. Ділянки ядер, що містять ДНК, фарбуються в червонувато-пурпурний колір (цитоплазма світло-зелена).