Приготування і фарбування мазка крові для підрахунку лейкоцитарної формули - основи гістології

Відео: Формені елементи крові: еритроцити, лейкоцити (Научфільм, навчальний відео СРСР)

Для морфологічного дослідження клітин крові і підрахунку лейкоцитарної формули готують мазок крові. Правильно зроблений і добре пофарбований мазок є абсолютно необхідною умовою для отримання достовірних результатів при вивченні морфологічних особливостей кров`яних клітин і підрахунку лейкоцитарної формули. Мазок крові повинен відповідати наступним вимогам: 1) починатися на 1 см від початку предметного скла і кінчатися на відстані 2-3 см від його протилежного краю, загальна довжина мазка повинна охоплювати 1 / 2-3 / 4 скла-2) бути рівномірної товщини, а не хвилеподібним, хороший мазок товщі за все спочатку, потім поступово стоншується і закінчується у вигляді сліду ( «вид щіточки») - 3) шар крові не повинен досягати країв скла, між ним і краєм скла завжди має бути кілька міліметрів вільного простору.
Мазки, що перевищують 3/4 довжини предметного скла, бувають дуже товстими. У них еритроцити лежать густим шаром, притиснуті один до одного і утворюють монетні стовпчики, що заважає досліднику розглянути їх морфологію. Мазки коротше Vi предметного скла дуже тонкі: лейкоцити лежать дуже рідко і деформовані. Якщо відсутній вільний від мазка край предметного скла (що буває при великому діаметрі шліфувального скла), то великі клітини переміщаються до краю мазка, внаслідок чого нерівномірно розподіляються в ньому.
У хвилеподібне мазку розподіл клітин крові також неправильне - товсті ділянки містять більше лімфоцитів, тонкі - більше моноцитів і сегментоядерних клітин.
Техніка приготування мазка. Предметні скла, на яких будуть робитися мазки крові, повинна бути добре знежирені і промиті. Для цієї мети їх поміщають в розчин хромпика (суміш К2Сг2О7 + міцна Н2 SО4) на 24 год (з хромпиком треба звертатися вкрай обережно, так як бризки від нього можуть пропалити одяг, панчохи). Потім скла промивають під проточною водою протягом 24 год, протирають насухо і кладуть в банку з сумішшю спирт-ефір. Перед вживанням їх сушать. До краплі крові торкаються предметним склом так, щоб воно не стосувалося пальця. Крапля крові переходить на скло. Для того щоб мазок був величиною в 1 / 2-3 / 4 предметного скла, крапля повинна бути діаметром 2-5 мм. Предметне скло беруть в ліву руку великим, вказівним і середнім пальцями так, щоб крапля крові була зверху. Шліфоване скло, яким будуть робити мазок, ставлять під кутом 30-45 ° на відстані 1-2 мм перед краплею, тримаючи його великим і вказівним пальцями правої руки. Шліфоване скло зрушують назад так, щоб воно торкнулося краплі крові і крапля розтеклася в кутку між шліфованим і предметним склом (рух назад допомагає також прибрати зайву кров, якщо крапля була занадто великий). Потім швидким рухом руки вперед роблять мазок. Потрібно, щоб при приготуванні мазка великий і вказівний пальці правої руки ковзали по краях предметного скла і створювали необхідну опору для рівномірного накладення шару крові. Шліфоване скло повинне бути вже, ніж предметне, щоб краю предметного скла були вільні від мазка.
Якщо ширина шліфованого скла така ж, як і предметного, то кути у шліфованого скла відламують, скорочуючи на 1-2 мм. Шліфоване скло можна замінити покривним.
Приготування гарного мазка крові, хоча і не є важкою справою, потребує певного досвіду. Слід пам`ятати, що невірно приготований мазок призводить до грубих помилок в результатах досліджень. Якість мазка є до певної міри «атестатом» роботи лаборанта.
Фарбування мазків крові. Приготовані таким способом мазки крові підсушують, потім фіксують за допомогою метилового спирту (3-5 хв) або абсолютного спирту (100%) (10-15 хв) або ацетону (5 хв). Найкращі результати дає все ж фіксація мазків метиловим спиртом *. Фіксують рідини денатурируют білки клітини при збереженні їх прижиттєвої структури, а також закріплюють мазки на стеклах. Нефіксовані мазки легко змиваються.

* Слід пам`ятати, що метиловий спирт є сильнодіючою отрутою, а ацетон-легкозаймистою і вибухонебезпечною рідиною, через що їх не можна залишати на робочому місці (до і після вживання), посуд має бути наочно етикетувати і зберігати розчин потрібно в сейфі.

Відео: гемосканування -"жива" крапля крові на ТП мікроскопі

Фіксують рідини наливають в достатній кількості на скла або скла з мазками занурюють в банку з фіксатором. Після фіксації і висушування мазків приступають до їх фарбування. Зазвичай застосовують метод Романовського-Гимзе. У лабораторіях завжди є готовий розчин розведеного барвника. Барвник Романовського-Гимзе складається з лужної (АЗУР II) і кислої (еозин) частин. Азур II забарвлює структури клітин в яскраво-синій колір, а еозин в розовокрасного. Лужні частини клітин зв`язуються і фарбуються кислими барвниками, а кислі - лужними.
Робочий розчин барвника отримують розведенням готового розчину дистильованою водою (1-2 краплі фарби на 1 мл дистильованої води). Для хорошого фарбування мазка мають значення якість барвника, реакція і температура води. Дуже важливо, щоб дистильована вода, в якій розчиняють барвник, мала нейтральну реакцію. Якщо реакція кисла, то слабким дією лужного елемента барвника білі кров`яні елементи фарбуються погано, а препарат стає червоним. Якщо вода має лужну реакцію, то слабшає дія кислого елемента фарби, лейкоцити забарвлюються занадто інтенсивно і препарат робиться синім. Реакцію води перевіряють за допомогою гематоксилінові проби. У 4-5 мл води кидають крупинку гематоксиліном. Якщо вода має целочную реакцію, то забарвиться раніше 3-й хвилини. Якщо фарбування спостерігається через 5 хв або зовсім не відбувається, то вода має кислу реакцію. Якщо ж вода забарвлюється через 1-4 хв в рожево-фіолетовий колір, то вона нейтральна і придатна до вживання. При кислій реакції води в неї додають по краплях 1% розчин карбонату натрію, поки гематоксилінові проба не стане характерною для нейтральної води. При лужної реакції додають по краплях 1% розчин оцтової кислоти. Для того щоб правильно оцінити результати проби, стаканчик з водою треба ставити на аркуш білого паперу.
Забарвлення мазків виробляють за методом Романовського-Гимзе наступним чином. Перед фарбуванням потрібно попередньо перевірити якість барвників, пофарбувавши і переглянувши кілька мазків для того щоб встановити час, краще для забарвлення. Робочий розчин фарби готують безпосередньо перед фарбуванням. Препарат поміщають мазком вниз на 2 скляні (дерев`яні) палички, покладені на дно чашки Петрі. Фарбу підливають під препарат. Фарбують 20-40 хвилин. Потім мазок промивають під струменем води, сушать і микроскопируют.
При фарбуванні мазків крові по методу Романовського-Гимзе еритроцити фарбуються в блідо-рожевий колір, ядра клітин - в синьо-фіолетовий, гранули еозинофілів - в яскраво-червоний, базофілів - в синій, цитоплазма лімфоцитів і моноцитів - у блакитний колір.