Обробка і фарбування кісткової тканини, декальцинація, фарбування - основи гістології
Обробка і фарбування кісткової тканини
Кісткова тканина за своїми фізичними властивостями займає особливе місце серед тканин організму. Наявність в її міжклітинному речовині солей кальцію надає тканині твердість, значно утрудняє приготування гістологічних препаратів, тому обробка кісткової тканини має свої особливості. Існують два основних способи отримання гістологічних препаратів: 1) приготування зрізів після спеціальної попередньої підготовки об`єкта, суть якої зводиться до розчинення і видалення з кісткової тканини неорганічних солей (декальцинація) - 2) приготування тонких кісткових пластинок (шлифов) зі шматочків нефіксованим компактної кістки шляхом сточування останніх.
декальцинація
Перш ніж приступити до декальцінаціі, кістка, як і будь-яку тканину, необхідно піддати фіксації. Вибір фіксатора залежить від цілей і характеру дослідження. Так, для оглядових препаратів і виявлення фібрилярних компонентів кісткової тканини застосовують чистий формалін (15-20% розчин), в той час як для цитологічних досліджень краще складні фіксатори, також містять формалін, бо він зменшує ступінь набухання волокнистих структур при подальшій обробці тканини (наприклад , фіксатор Штіве: насичений водний розчин дихлорида ртуті - 76 мл, формалін - 20 мл, крижана оцтова кислота - 4 мл).
Для фіксації слід випилювати лобзиком невеликі шматочки кістки (товщиною 0,5-1 см), так як через високу щільності тканини фіксатор проникає повільно. Термін фіксації залежить від товщини шматочка (не менше 48 год).
Після закінчення фіксації об`єкт ретельно промивають в проточній водопровідній воді або спирті (наприклад, після складних фіксаторів, що містять дихлорид ртуті), так як при подальшій обробці кислотами можуть утворитися важкорозчинні опади. Після цього з метою знежирення препарат проводять через ряд спиртів підвищується концентрації (50, 70 і 96%), а потім доводять до води через спирти низхідній концентрації.
Декальцинація досягається обробкою кісткової тканини за допомогою декальцінуючі рідин, що володіють властивостями розчиняти неорганічні солі, не пошкоджуючи структурні елементи кістки.
При декальцінаціі слід дотримуватися наступних основних правил:
- застосовувати велику кількість декальцінуючі рідини і змінювати її щодня (об`єм рідини повинен перевищувати обсяг об`єкта не менше ніж в 50-70 разів);
- декальцініруемий об`єкт поміщати в верхньому шарі рідини, щоб забезпечити опускання на дно розчиняються солей (підвішування шматочків на нитці або в скляному ситі);
- проводити декальцинацію до повного видалення мінеральних солей (але не перетримувати матеріал в рідинах, так як це призводить до набухання фібрил і погіршення окрашиваемости структур).
Декальцинація вважається повною тоді, коли об`єкт стає м`яким і ріжеться ножем легко і без хрускоту. Хід процесу можна перевіряти за ступенем занурення в об`єкт препаровальной голки. Згинати препарат і натискати на нього не рекомендується, так як це призводить до пошкодження тонких структур кістки.
Декальцинація у водному розчині азотної кислоти (5-7,5%) є найбільш поширеним способом. Для приготування робочого розчину в мірний посуд наливають 5-7,5 мл хімічно чистої концентрованої азотної кислоти (щільність 1,40) і доливають до 100 мл дистильованою водою (розчин можна готувати про запас у великих кількостях, розрахувавши загальну потребу). Застосовувати нижчі і вищі концентрації розчину для декальцінаціі кістки не рекомендується, так як перші викликають набухання, а другі - пошкодження клітинних структур. Більш високі концентрації (до 10%) використовують лише для декальцінаціі зубів.
Налив потрібну кількість рідини в відповідний скляну посудину, в неї підвішують підготовлений до декальцінаціі шматочок кістки. Розчин змінюють щодня до настання повної декальцінаціі. Термін декальцінаціі залежить від властивостей об`єкта (щільність, величина) і концентрації азотної кислоти. Середня тривалість декальцінаціі невеликих шматочків компактної кісткової тканини 10-12 діб.
Після закінчення декальцінаціі для усунення набухання волокнистих структур препарат підвішують на 24 год в 5% розчин сульфату натрію або літію (в разі відсутності таких солей кістка слід помістити в 96% спирт) і лише після цього ретельно промивають протягом 1-2сут в проточній водопровідній воді .
Можна скоротити термін отримання декальцінірованний кістки, помістивши випиляний шматочок безпосередньо в 5% розчин трихлороцтової кислоти, що містить 10-20% формаліну. Ця суміш одночасно фіксує і декальцінуючі. Маленький шматочок середньої щільності можна декальцінірованний за 3-5 днів. Після декальцінаціі промивають в спирті (ні в якому разі не в воді!).
Існує ряд інших способів декальцінаціі, але всі вони засновані на одному і тому ж принципі і вимагають дотримання викладених вище загальних правил.
Після декальцінаціі кісткову тканину можна різати на заморожувати мікротому, а також заливати в целлоидин або целлоидин-парафін звичайним шляхом. Заливка в парафін не рекомендується, так як він погано просочує декальцінірованний кістка.
В даний час вітчизняна промисловість почала випускати спеціальний мікротом санного типу, що дозволяє різати кістка без попередньої декальцінаціі, отримуючи зрізи товщиною 20-50 мкм.
фарбування
Найбільш поширений метод фарбування зрізів декальцінірованний кісткової тканини - по Шморля (тіонінпікріновая кислота). Робочі розчини: А - насичений розчин тіоніном в 50% спирті, Б 1% водний розчин фенолу, В - насичений розчин пікринової кислоти.
Перед вживанням зливають 1 частина розчину А з 10 частинами розчину Б. Знаходяться в воді зрізи переносять на 10 хв в отриману суміш, після чого споліскують в дистильованої воді і поміщають на 30-60 с в насичений розчин пікринової кислоти. Потім зрізи знову споліскують в дистильованої воді і диференціюють в 70 ° спирті до отримання темно-червоного забарвлення. Після цього їх переносять в 96 ° спирт, в якому продовжують диференціювання (під контролем в мікроскоп) до тих пір, поки загальний фон зрізу не набуде корічневий4 (або болотний) колір, а кісткові клітки і їх відростки - червоний. Пофарбовані зрізи потім проводять через 96% і абсолютний спирт, карбол-толуол, толуол і укладають в бальзам.
Якщо зріз погано забарвлюється через тривалу декальцінаціі в азотній кислоті, його потрібно попередньо помістити на 2-3 ч в 0,5% аміачну воду, після чого добре промити в дистильованої воді і потім пофарбувати.
