Гистохимія нервової системи - основи гістології

За останні роки в гістологічних лабораторіях широко застосовуються нейрогістохіміческіе методи, які на відміну від класичних нейрогистологічних методів дають можливість виявити функціональну характеристику елементів різних відділів нервової системи. Найбільш поширені і доступні з них - це методи визначення холинергических і адренергічних компонентів.

Метод виявлення адренергічних компонентів нервової системи

 (Метод Фалька - Хілларпа без ліофілізації) *
Метод заснований на здатності катехоламінів флюоресцировать після обробки парами параформальдегіду в прохідному ультрафіолетовому промінні. В результаті структури, що містять катехоламіни, світяться жовто-зеленим світлом. Слід зазначити, що даний метод є специфічним не тільки для нервової системи, але і для інших тканин організму, що містять катехоламіни (мозкова речовина надниркових залоз та ін.).

* Даний метод придатний для виявлення адренергічних нервових волокон у всіх органах, за винятком головного мозку і печінки-для роботи з цими тканинами необхідно після заморожування застосування ліофільної сушки шматочків і просочування парафіном в вакуумі.

Приготування параформальдегіду певної вологості. Залежно від необхідної вологості параформальдегіду на дно ексикатора наливають сірчану кислоту певної концентрації. Параформальдегід, що знаходиться в чашці, витримують в ексикаторі на підставці протягом 7-10 днів.
Схема отримання параформальдегіду певної вологості

Для більшості органів рекомендується параформальдегід 60% вологості.
Метод. 1. Шматочки досліджуваного органу заморожують сухим льодом.

2. У криостате готують зрізи товщиною 15-30 мкм (залежно від органу), які переносять на скло і висушують в потоці теплого повітря протягом 5-7 хв.

3. Встановлюють скла в штатив і поміщають в скляну посудину об`ємом 1 л, на дно якого насипають 5-6 г параформальдегіду, що має відповідну вологість, після чого посудину щільно закривають і ставлять в термостат з температурою + 80 ° С на 60 хв. Зрізи витягають і укладають в рідкий парафін (вазелінове масло) і досліджують в люмінесцентному мікроскопі з використанням світлофільтрів СЗС-14-4, ФС-14, ФС-1-2 і замикає світлофільтру ЖС-18 (до і після перегляду скла обов`язково повинні зберігатися в темряві, щоб уникнути згасання флюоресценції).
Для проведення контролю реакції на специфічність частина стекол зі зрізами нагрівають в термостаті в скляному циліндрі без параформальдегіду в тих же умовах.

Метод виявлення холинергических компонентів нервової системи (метод Карновского)

На відміну від попереднього методу, заснованого на прямому виявленні катехоламінів в тканинах, даний метод базується на виявленні активності ацетилхолінестерази, який каталізує процес розщеплення нейромедіатора ацетилхоліну в місці його локалізації (нейроціт і його відростки). Виявлення структур відбувається в результаті випадання пофарбованого продукту реакції фермент субстрат.
Приготування інкубаційного середовища
Для приготування інкубаційного середовища застосовують такі розчини.

1. а) 0,2 М NaOH: 0,8 г NaOH + 100 мл Н2 О. б) 0,2 М NaH-малеїнова сіль (розчин):

2,32 г малеїновий кислоти + 60,0 мл Н2 О + 0,8 г NaOH і доведення до 100 мл.
З двох розчинів готують перший робочий розчин: 26,9 мл 0,2 М ОН + 50,0мл 0,2 М NaH-малеїнова сіль + Н2О до 200 мл.

1. Цитрат натрію 0,1: 2,59 г Na3C6H5О7 + 100 мл Н2О.
2. C11SO4. 6Н2 О: 0,375 г C11SO4 + 50,0 мл Н2О.
3. Червона кров`яна сіль: 0,083 г K3Fe (CN) 6 + 50,0 мл Н2О.

Інкубаційного середовища готують перед вживанням, змішують у зазначеній нижче послідовності і добре струшують.
Ацетілтіохолінйодіда 10 мг
Кислого малеіновокіслого Na 0,2 М (pH 6,05) 13 мл
Цитрату натрію 0,1 М 1 мл
CuSО4 30 М 2 мл
Дистильованої води 2 мл
K3Fe (CN) 6 5 М 2 мл
У контролі замість ацетілтіохолінйодіда застосовують бутірілтіохолінйодід і тієї ж концентрації.
Метод. 1. Шматочки досліджуваного органу (розмір 3x3 мм) фіксувати протягом 2,5-3,5 год при температурі + 2- + 4 ° С в 4% розчині формаліну, забуферованого до pH 7,6 за допомогою 0,075М фосфатного буфера, що містить 0,044 М сахарозу.

Відео: Урок біології №45. Будова і функції відділів головного мозку

1. Промокнути і помістити в 0,044 М сахарозу при температурі + 2- + 4 ° С на 15-16 год, після чого знову промокнути і швидко заморозити сухим льодом.
2. Нарізати зрізи в криостате (товщиною 1-30мкм), перенести на скла, підсушити на повітрі і помістити в інкубаційного середовища на 60 хв (при температурі + 37 ° С).
3. Перенести скла зі зрізами в стаканчик з 10% формаліном, приготованим на фізіологічному розчині хлориду натрію, на 10 хв.
4. Обполоснути в двох порціях дистильованої води, підфарбувати карміном і зробити висновок, як зазвичай, в канадський бальзам.

результат. Холинергические компоненти, цитоплазма нейроцитів і нервові волокна забарвлюються в коричневий колір, інтенсивність якого прямо пропорційна активності ферменту.