Фарбування тканини за методом ван-гізоном, маллорі - основи гістології
Фарбування сполучної і м`язової тканини за методом ван Гізоном
Цей метод має ряд переваг в порівнянні з забарвленням гематоксилін-еозином, так як по-різному забарвлюються різні компоненти тканини. При фарбуванні за методом ван Гізоном вживаються два розчину: а залізний гематоксилін Вейгерта (приготування див. Нижче) і б) замість еозину кислу суміш пикрофуксином. Колагенові волокна сполучної тканини після фарбування пикрофуксином мають яскраво-червоний колір, а м`язові та еластичні волокна - буро-червоний або жовто-зелений. Залізний гематоксилін Вейгерта забарвлює Ядра в темно-коричневий або буро-чорний колір. Можна підфарбовувати ядра і міцним розчином гематоксиліном Бемера (без диференціювання).
робочі розчини
Гематоксилін Вейгерта готують безпосередньо перед фарбуванням, змішуючи рівні об`єми основних розчинів Вейгерта (першого і другого), які зберігають окремо.
Перший розчин Вейгерта: в 100мл 96% спирту розчиняють 1 г гематоксіліна- другий розчин: 4 мл 29% розчину хлориду заліза (3 +) * зливають з 1 мл міцної соляної кислоти і додають 95 мл дистильованої води.
* При відсутності хлориду заліза (3 +) можна користуватися 2-3% розчином железоаммоніевие квасцов.
При змішуванні розчинів доливають другий розчин до першого не в рівному, а в кілька меншій кількості, а потім додають другий розчин до отриманої суміші по краплях з піпетки до рівної кількості з першим розчином.
В силу зміни поверхневого натягу розчину він починає підніматися по стінках посудини (бюкса) і збирається в краплі, які знову стікають в рідину. Таке явище вказує на правильне кількісне співвідношення першого і другого розчинів Вейгерта в суміші, і тоді додавання другого розчину треба припинити. Барвник, якщо він правильно приготований, темно-фіолетового кольору. Якщо він бурого кольору, то є надлишок другого розчину. Ядра таким барвником забарвлюватимуться не в чорний, а в бурий колір.
Розчини Вейгерта окремо можна зберігати роками, їх суміш -не більше 3-4 днів, тому краще всього користуватися свіжим розчином.
Розчин пикрофуксином: до 100мл насиченого водного розчину пікринової кислоти додають 4-10 мл 1% водного розчину кислого фуксину.
Якщо потрібно терміново приготувати дуже невелика кількість розчину, то в пляшечку з-під пеніциліну наливають профільтрований насичений розчин пікринової кислоти (половину бульбашки) і до нього по краплях додають 1% розчин кислого фуксину. При цьому контролем може служити крапля суміші на фільтрувальної папері, яка повинна мати колір свіжої крові.
фарбування
- З дистильованої води зрізи перенести в гематоксилин Вейгерта на 2-5 хв. Забарвлення ядер треба контролювати під мікроскопом.
- Обполоснути зрізи в дистильованої воді і перенести в водопровідну воду на 10 хв (воду потрібно змінити).
- Помістити зрізи на 1-2-3 хв (іноді на Vi хв) в пикрофуксином.
- Швидко (5-10с) сполоснути зрізи в дистильованої воді, провести їх дуже швидко через 96% спирт (можна змінити), просветлить в карбол-толуоле, толуолі і укласти в канадський бальзам. Результат: колагенові волокна яскраво-червоного кольору, а м`язові та еластичні - буро-жовтого або жовто-зеленого. Ядра бурокорічневого або буро-чорного кольору.
Особливості забарвлення.
Необхідний постійний контроль під мікроскопом. Якщо ядра набувають бурий, а не чорний колір, то слід довше потримати зрізи в гематоксиліном або менше в пикрофуксином, так як пикрофуксином володіє сильно диференціюються дією відносно гематоксиліном.
Якщо волокна сполучної тканини забарвлюються в інтенсивно червоний колір, то слід після пикрофуксином довше полоскати зрізи в воді, де кислий фуксин розчиняється. Якщо, навпаки, сполучна тканина блідо забарвилася фуксином, необхідно дуже швидко обполоснути зрізи в воді або навіть не обполіскувати зовсім і відразу перенести в спирти.
Якщо виходить слабка забарвлення пікринової кислотою (клітини залоз, гладкі м`язи), то необхідно прискорити проводку зі спиртами, так як вони беруть із препарату пикриновую кислоту. При перефарбування препарату пікринової кислотою необхідно збільшити час перебування зрізу в спиртах.
Істотним недоліком цього методу є вицвітання препаратів, тому їх не можна зберігати тривалий час. Можна використовувати гематоксилин Майера, карацу, Ерліха, але гематоксилин Вейгерта дає кращу забарвлення.
Забарвлення сполучної тканини за методом Маллорі
Фарбуються парафінові і целлоідіновие зрізи.
Метод добре виявляє різні елементи сполучної тканини, особливо колагенові і ретикулярні волокна. Його можна використовувати і для фарбування м`язової та інших тканин.
Матеріал краще фіксувати в сулемового фіксаторах, особливо в суміші Ценкера.
Якщо матеріал зафіксований в формаліні, то перед фарбуванням зрізи слід поміщати в рідину Ценкера на 15-30 хв. Потім на кілька хвилин зрізи занурюють в спиртовий розчин йоду, що дозволяє звільнити зрізи від опадів дихлорида ртуті. Після цього зрізи поміщають в 0,25% розчин тіосульфату натрію (гіпосульфіту), щоб відновити йод.
робочі розчини
Необхідно мати три робочих розчину.
Водний розчин кислого фуксину 0,1%.
Розчин фосфорно-молібденової кислоти 1%.
Суміш, що складається з анілінового синього, оранжевого Г і щавлевої кислоти. Для приготування фарбувальної суміші 0,5 г анілінового синього, 2 г оранжевого Г і 2 г щавлевої кислоти розчиняють в 100 мл дистильованої води. Цю суміш нагрівають до кипіння, охолоджують і фільтрують. Коли складові частини розчиняються, суміш набуває інтенсивно коричневий колір з зеленуватим відтінком. Розчин придатний до вживання відразу після приготування. Після довгого зберігання перед вживанням розчин необхідно прокип`ятити і профільтрувати.
фарбування
- Після звільнення від парафіну зрізи з дистильованої води переносять в розчин 0,1% кислого фуксину на 2-3 хв.
- Швидко промивають в дистильованої воді 1-2 хв.
- Для закріплення, забарвлення кислим фуксином зрізи переносять в 1% розчин фосфорно-молібденової кислоти на 3-5 хв.
- Швидко споліскують в дистильованої воді.
- Переносять зрізи в свежепрофільтрованную суміш анілінового синього, оранжевого Г і щавлевої кислоти на 1 хв (слід уникати перефарбування).
- Промивають зрізи в дистильованої воді.
- Диференціюють в 96% спирті 3-5 хв і більше, поки під мікроскопом чи не з`являться пофарбовані в синій колір колагенові волокна.
- Проводять через абсолютний спирт, ксилол, укладають в канадський бальзам.
Результат.
Колагенові і ретикулярні волокна темно-синього кольору, слиз - синього, еритроцити - червоно-оранжевого, м`язові волокна - яскраво оранжевого, хроматин - червоного з жовтуватим відтінком, нейроглії і гангліозних клітини - червонувато-фіолетового, секреторний гранули - червоного кольору.
