Виявлення та ідентифікація кислихмукополісахаридів - основи гістології

Виявлення та ідентифікація кислихмукополісахаридів (глікозаміногліканів)

Переконливі дані про наявність кислихмукополісахаридів можна отримати при сукупному застосуванні таких методів.
Виявлення кислихмукополісахаридів за методом Галі (Хейла) (свіжозаморожені зрізи, фіксатори - формалін, рідина Карнуа- заливка в парафін). Розчин колоїдного заліза. У 100 мл киплячої дистильованої води влити при помішуванні 8-12 мл 10% розчину хлориду заліза, колір розчину змінюється від коричневого до темно-червоного. Для видалення з нього НС1 виробляють діаліз.
Розчин оцтової кислоти - 2М.
Підкисленою розчин гексациано-феррата (2) калію - жовтої кров`яної солі і НС1.
Метод. 1. Зрізи товщиною 5-7 мкм Депарафінірованние і довести до води.

1. Злити рівні об`єми діалізували хлориду заліза і 2М розчину оцтової кислоти. Помістити зрізи в цей розчин на 10-15 хв.
2. Ретельно промити в декількох працях дистильованої води.
3. Обробити свіжоприготовленим розчином жовтої кров`яної солі протягом 10 хв.
4. Обполоснути в дистильованої воді.
5. Докрасіть ядра одним з ядерних барвників (квасцовий кармін, гематоксилин і ін.).
6. Збезводнити, просветлить, укласти в бальзам.

Результат. Кислі мукополісахариди пофарбовані в синій колір, ядра - в червоний.
Виявлення кислихмукополісахаридів альциановим синім по Стідмену (фіксатори - Карнуа, Буена, формалін- заливка в парафін). Метод заснований на утворенні хімічних зв`язків між кислотними групами кислихмукополісахаридів (глікозаміногліканів) з альциановим синім. Застосовують для виявлення муцинов епітелію і сполучної тканини.
Приготування розчину альцианового синього. 0,1 г барвника розчинити в 100 мл 3% оцтової кислоти і відфільтрувати.
Метод. 1. Зрізи товщиною 5-7 мкм Депарафінірованние і довести до води.

1. Пофарбувати в свежеотфільтрованном розчині альцианового синього протягом 10-30 с.
2. Промити в дистильованої воді.
3. Пофарбувати гемалауном Ерліха протягом 5-10 хв.
4. Диференціювати в 1% розчині спирту.
5. Промити в проточній воді 10-20 хв.
6. Збезводнити, просветлить, укласти в бальзам.

Результат. Кислі мукополісахариди синьо-зеленого кольору, ядра - темно-сині або темно-червоні.
Методи, засновані на метахромазії. Метахромазія - це таке фарбування тканин, коли в результаті хімічної реакції тканину - барвник колір забарвлених структур значно відрізняється від початкового кольору барвника.
Практично під метахромазією прийнято мати на увазі явища, що спостерігаються при використанні барвників тіазинових групи.
Виявлення метахромазії за допомогою толуїдинового синього (свіжозаморожені або фіксовані формаліном зрізи, парафінові зрізи). 1. Зрізи товщиною 5-7 мкм довести до води.

1. Помістити на 4-6 ч в 0,5% водний розчин толуїдинового синього.
2. Обполоснути в дистильованої воді.
3. Для гістохімічних цілей негайно дослідити в воді.

Результат. Метахроматичні речовини червоні, рожеві (у-метахромазія) або пурпурні (р-метахромазія).
Існують засновані на метахромазії методи отримання постійних препаратів.

Диференціація кислихмукополісахаридів

Кислі мукополісахариди, як правило, не дають позитивної ШИК-реакції, але фарбуються альциановим синім, колоїдним залізом і дають метахроматичні фарбування.
Кислі мукополісахариди поділяють на несульфатованих (гіалуронова кислота і хондроїтин) і сульфатованих (хондроітінсульфата А, В, С, кератосульфат, гепарінсульфати, гепарин).
Обробка гіалуронідазами. Одні Депарафінірованние і доведені до води зрізи (контрольні) інкубують при 37 ° С в розчині тестикулярной гіалуронідази, приготованому на фізіологічному розчині хлориду натрію (1 мг ферменту на 1 мл розчину) протягом 3 год, інші - в чистому фізіологічному розчині хлориду натрію (при тих же умовах). Потім всі зрізи забарвлюють одним з методів на кислі мукополісахариди. Відсутність забарвлення в контрольних зрізах і наявність в інших свідчать про те, що в тканинах знаходиться гіалуронова кислота і хондроитинсульфат С і А.
Якщо замість тестикулярной гіалуронідази застосувати бактеріальну (фермент діє більш м`яко), то можна диференціювати гіалуронову кислоту.
Реакція метилування. Деперафінірованние контрольні зрізи поміщають з води в 0,1N розчин хлористоводневої кислоти в абсолютному метанолі і інкубують при 58 ° С протягом 2-3 год. Потім разом з іншими зрізами фарбують або альциановим або толуїдиновим синім. Відсутність забарвлення в контрольних зрізах і наявність в інших свідчать про те, що в досліджуваних тканинах знаходяться сульфатованих мукополісахариди (метилювання призвело до їх десульфатірованію).