Промивання, зневоднення гістологічного матеріалу - основи гістології

Успішна фіксація досліджуваного об`єкта - лише перша умова, необхідне для приготування якісних мікропрепаратів. Однак для того, щоб домогтися отримання тонких зрізів (в тисячні частки міліметра), зафіксований матеріал необхідно відповідним чином підготувати: зробити досить щільним і в той же час нехрупкій. Потрібно надати йому такий стан, щоб при різанні він не кришився і не деформувався, а зрізався тонкими рівними шарами. Для цього тканину слід звільнити від надлишків фіксатора, знешкодити, просочити і залити якийсь ущільнюючої середовищем.

промивання

Мета цієї процедури - звільнити досліджуваний об`єкт від зайвої кількості фіксатора. Спосіб промивання залежить від методики фіксації. Наприклад, після фіксують сумішей, що містять пикриновую кислоту, дихлорид ртуті, трихлоруксусную кислоту, застосовують етиловий спирт різної концентрації (див. Попередній розділ). Після фіксації у формаліні, в рідинах, що містять хром, осмієва кислоту, зазвичай вживають воду. У більшості випадків промивку шматочків тканин виробляють в проточній водопровідній воді. Найбільш зручно це робити, поміщаючи об`єкт в скляні або фарфорові сита (рис. 60), які закривають пробкою і опускають в посудину з проточною водою. Пробка забезпечує плавучість, а отвори - постійну циркуляцію води. Якщо шматочок не прошу ниткою, то етикетку також поміщають в сито. При відсутності сита шматочок загортають у марлю і підвішують за нитку в посудину, наповнений водою. Верх посудини закривають марлею і проробляють в ній невеликий отвір. На водопровідний кран натягують гумовий шланг або прив`язують шнур (смужку бинта), вільний кінець якого пропускають через марлю в посудину і пускають по ньому несильно струмінь води. Середній час промивання 20 - 24г.

зневоднення

Починаючи з цього етапу і до самого кінцевого моменту приготування гістологічного препарату слід строго дотримуватися правила поступового впливу застосовуваних речовин на досліджувані тканини.
Мал. 60.
Промивання матеріалу після фіксації.

Після промивання шматочки піддають подальшому ущільнення шляхом зневоднення в спиртах зростаючої концентрації.
Для проведення процедури готують необхідну кількість стаканчика чи стаканчиків з притертими кришками, етикетують їх і заливають спиртами: 50, 60, 70, 80 і 96% (по два стаканчика), 100% (два стаканчика). Такий послідовний ряд судин отримав назву гістологічної батареї.
Таблиця 2
Приготування спиртів різної концентрації

Спирти потрібної фортеці готують заздалегідь за спеціальною таблицею розведення (табл. 2) з 96% спирту (для того щоб приготувати 100 мл спирту міцністю 60%, необхідно взяти 63 мл 96% спирту і 37 мл дистильованої води і т. Д.).
Спосіб приготування абсолютного спирту. Звичайний спирт-ректифікат містить 96% чистого спирту і 4% води. Для того щоб отримати абсолютний спирт, необхідно витягти воду. Найбільш поширеним способом є зневоднення за допомогою прокаленного мідного купоросу (сульфат міді).
В основі цього методу лежить властивість сульфату міді віддавати і приєднувати молекули води, міняючи при цьому свій колір (прожарений сульфат міді має вигляд сероватобелого порошка- який у міру приєднання води набуває синього забарвлення).
Насипавши порошок прокаленного мідного купоросу (приблизно 10 г на 100 мл спирту) в чисту скляну пляшку з притертою пробкою, наливають туди ж 96% спирт. Потім пляшку струшують до рівномірного розподілу порошку. Подібну процедуру повторюють протягом 1-2 днів. У міру поглинання води порошок набуває синього забарвлення. Одноразова обробка, як правило, не дає зневоднення, тому спирт переливають в іншу посудину, що містить свіжу порцію сульфату міді. Подібну процедуру повторюють до тих пір, поки осад не перестане купувати блакитний колір. Зневоднений спирт фільтрують в чистий посуд, яку щільно закривають. Бажано перевірити pH абсолютного спирту, так як після обробки сульфатом міді він може стати злегка підкисленим. Для нейтралізації досить додати невелику кількість карбонату кальцію (СаСО3).
Якщо в лабораторії немає фабричного порошку безводного сульфату міді, то його можна приготувати самим, прокалив кристалічну сіль над вогнем в широкій порцелянової чашці (до тих пір, поки з синіх кристалів не утворюється білий порошок). Для рівномірного прожарювання необхідно перемішувати купорос скляною паличкою. Не можна допускати почорніння (особливо помітного по краях чашки), що свідчить про перегрівання. Таким же шляхом обробляють мідний купорос, що залишився після зневоднення спирту.
Слід пам`ятати, що порошок мідного купоросу сильно подразнює слизові оболонки. Потрібно проводити прожарювання в витяжній шафі або ж захищати слизові оболонки носа і рота звичайною марлевою маскою.
Випробування абсолютного спирту на вміст води виробляють опусканням в нього декількох зерен карбіду кальцію. Поява характерного запаху ацетилену і помутніння свідчать про наявність води. Більш брутальний спосіб - додаток декількох крапель абсолютного спирту до 4-5 мл бензолу або ксилолу. Помутніння рідини вказує на те, що спирт містить близько 3% води.
Якщо препарат промивали у воді, то зневоднення починають з 50% спирту, якщо ж в спиртах (після рідини Ценкера і ін.), То об`єкт поміщають в спирт подальшої фортеці (з 70% в 80% і т. Д.). При тонких цитологічних дослідженнях зневоднення починають з 10-20% спирту. Час перебування шматочків в окремих спиртах визначається їх величиною і властивостями. Об`єкти середньої величини (товщиною 5 мм) досить тримати в слабких спиртах (до 60%) по 2-4 ч, а в більш міцних - від 12 до 24 год. Дрібні і більш тонкі об`єкти можна проводити відповідно швидше.
Для того щоб спирт проникав в тканини рівномірно з усіх боків, об`єкт поміщають на шар вати (звичайної або скляної) або підвішують у скляному ситі. При такому розташуванні шматочків спирт, який забирає воду з тканин і стікає на дно, не заважає подальшому зневоднення.
Слід пам`ятати, що тривале перебування об`єкта в спиртах низької концентрації призводить до мацерації тканин, в той час як пересмикування в спиртах високої концентрації надмірно ущільнює їх. Тому, якщо необхідно перервати процес зневоднення, то матеріал можна залишити (на кілька днів) в «индифферентном» спирті, міцність якого складає 70-80%.
Необхідно також враховувати, що спирти в процесі зневоднення досить швидко забруднюються екстрагуються з тканин речовинами і особливо жирами. Не слід використовувати тривалий час одні і ті ж спирти. Необхідно своєчасно їх міняти.
У процесі зневоднення можуть бути допущені помилки: 1) переуплотнение при повному обезвожіваніі- 2) нормальне ущільнення при недостатньому зневодненні. Обидва ці нестачі є наслідком недотримання оптимальних умов зневоднення і негативно позначаються на подальшій обробці матеріалу. Досягнення хороших результатів дається тільки досвідом, тому необхідно ретельно реєструвати всі етапи і уважно аналізувати результати (особливо при освоєнні методів).
Перед тим як перенести об`єкт в 96% або абсолютний спирт, слід надати шматочку остаточну форму і розміри (обрізати пошкоджені або зайві ділянки). Для повного зневоднення слід проводити матеріал послідовно через дві порції абсолютного спирту (по 12-24 год).