Фарбування і висновок зрізів - основи гістології
Для того щоб зріз, приготований одним із зазначених вище способів, можна було дослідити в мікроскоп, необхідно, щоб структурні компоненти складових його тканин були добре помітні в світлі і щоб зріз був захищений від можливого забруднення і пошкодження. Тому подальша обробка зрізу передбачає його фарбування, просвітлення і висновок.
загальні зауваження
Незважаючи на те, що фарбування зрізів має давню історію, до теперішнього часу повністю незрозуміла суть механізмів дії багатьох барвників. Безсумнівно лише, що в основі фарбування тканинних мікроструктур лежать фізико-хімічні процеси. З фізичних факторів в першу чергу слід відзначити явища дифузії (проникнення), адсорбції (поверхневе вбирання) і абсорбції (глибоке просочування) барвника, а також його розчинність, з хімічних - електролітичні властивості фарбувальних розчинів і самих тканин. Важливе значення мають щільність тканин і дисперсність барвника. Перше властивість визначає послідовність фарбування окремих структур, друге - швидкість процесу фарбування.
Саме на електролітичних властивостях грунтується поділ застосовуваних в гістологічної практиці барвників на три групи: основні, кислотні і нейтральні.
Основний барвник є барвник підставу або його сіль і забарвлює клітинні і тканинні структури кислої природи, наприклад хроматин ядра, що містить ДНК, і ядерце, що містить РНК. Звідси і термін базофилия (люблячий підставу) для позначення тканинних компонентів, забарвлюються основними барвниками (метіонін, гематоксилин, метиловий зелений і ін.).
Кислотний барвник - це красящая кислота або її сіль, в силу чого він забарвлює речовини і частки основної природи, наприклад гранули еозинофільних лейкоцитів, цитоплазму деяких клітин передньої долі гіпофіза і ін. Звідси і термін оксіфілія (ацидофільний - люблячий кислоту) для тканинних елементів, фарбувальних кислотними барвниками. У цю групу речовин входять еозин, еритрозин, кислотний фуксин, конго червоний і ін.
Нейтральний барвник утворюється при з`єднанні водних розчинів кислотного і основного барвників (з`єднання фарбувальної кислоти з барвником підставою). До цієї групи належать судан, еозіновокіслий метиленовийсиній і ін.
Не слід плутати нейтральний барвник з нейтральною фарбувальної сумішшю, для якої характерно одночасно присутність в розчині основного і кислотного барвників. Термін же нейтрофилия застосуємо до результатів фарбування обома групами барвників, так як відображає не властивість барвника, а рівновага між кислотними і основними властивостями офарблюваних елементів.
Слід пам`ятати, що на якість забарвлення і її стійкість значний вплив можуть надавати спосіб фіксації, попередня і наступна обробка препаратів. Тому потрібно строго дотримуватися всі методичні вказівки та загальні правила фарбування.
Необхідно також підкреслити, що більшість гістологічних барвників неспецифічної, т. Е. Не розкриває хімічну природу тканинних компонентів. З їх допомогою можна вивчати лише морфологічні особливості мікроструктур.
Барвники, що застосовуються для гістологічних цілей, ділять на природні та штучні.
Розрізняють декілька типів гістологічного фарбування: прогресивний, регресивний, прямий, непрямий, простий і складний.
Прогресивне фарбування - це такий спосіб, при якому зрізи знаходяться в барвнику до тих пір, поки не досягнуть необхідного рівня окрашиваемости.
Регресивний - зрізи спочатку перефарбовують, а потім доводять до необхідної забарвлення шляхом відмивання в відповідної рідини, що дозволяє більш чітко виділити окремі елементи тканин.
Слід постійно пам`ятати: а) про ретельному видаленні відмивали рідини (в іншому випадку вона буде продовжувати діяти і спотворить результат забарвлення) - б) про найбільш зручною застосуванні тонких срезов- в) про те, що розведені барвники дають кращі результати, ніж міцні розчини (товсті зрізи і висока концентрація барвника ускладнюють диференціювання і призводять до нерівномірного забарвленням зрізів) - г) про те, що забарвлення потрібно проводити під контролем мікроскопа.
Застосування регресивних методів забарвлення вимагає певної навички, який набувається поступово.
Пряме фарбування - фарбування об`єкта безпосередньо в розчині барвника, непряме (протравні) - зріз фарбують потрібним барвником лише після попередньої обробки спеціальними протравними барвниками.
При простому фарбуванні застосовують один барвник. Складне фарбування передбачає обробку препарату декількома барвниками (двома і більше) одночасно або послідовно (див. Забарвлення гематоксилін-еозином, фарбування за методом Ван-Гізоном).
Всі методи гістологічного фарбування можна розділити на дві основні групи: а) оглядові, використовувані для отримання загального орієнтовного уявлення про досліджуваному об`єкті (фарбуються переважно ядра і цитоплазма клітин) - б) спеціальні, які дозволяють фарбувати саме ті тканинні і клітинні елементи, які цікавлять дослідника (органели клітини, волокнисті структури і т. д.). Методи, що становлять другу групу, більш складні і вимагають особливих способів фіксації.
Для того щоб отримати хороші результати при будь-якому методі забарвлення гістологічних препаратів, необхідно дотримуватися певних правил.
Відео: Забарвлення гематоксиліном і еозином
- Фарбувальні розчини повинні бути чистими, тому будь-який барвник необхідно перед вживанням відфільтрувати, а водний розчин готувати тільки на дистильованої воді.
Мал. 77.
Розташування біологічних стаканчиків (батарея) для послідовної обробки наклеєних на скло зрізів (депарафінірованіе, зневоднення).
- Віддавати перевагу: а) фарбування барвниками низькій концентрації протягом тривалого часу перед короткочасної забарвленням барвниками високої концентрації-б) застосування регресивних методів.
- Ретельно виконувати всі процедури при підготовці зрізу до фарбування і подальшої його обробки.
техніка фарбування
Попередня підготовка. Перед тим як приступити до фарбування зрізів, їх, як правило, піддають спеціальній попередній обробці, характер якої залежить від методів фіксації матеріалу і приготування зрізів.
Парафінові зрізи вимагають найбільш складною підготовки. Так як парафін не володіє достатньою прозорістю і ускладнює процес фарбування (гістологічні барвники - це водні або спиртові розчини, погано проникають в парафіновані тканини), його необхідно видалити з зрізу. Для цього зріз піддають депарафінірованію - процесу, зворотному тому, який здійснюють при підготовці об`єкту до заливання в парафін, т. Е. Зрізи послідовно проводять через розчинник парафіну, спирти низхідній концентрації і поміщають в воду. Практично це здійснюють так.
Можна одну зміну 96% спирту замінити порцією абсолютного спирту, а замість 70% застосувати 80% або 60% спирт. Важливо зберегти лише принципову схему.
Етикетують біологічні стаканчики (або високі бюкси), наливають в них відповідні розчини і встановлюють в певній послідовності (рис. 77), що забезпечує проведення маніпуляцій за наступною схемою.
Примітка. У тих випадках, коли матеріал був фіксований в рідинах, що містять дихлорид ртуті, зрізи необхідно піддати додатковій обробці, помістивши їх після 96 ° спирту в йодований спирт. Час перебування зрізу в розчині встановлюють дослідним шляхом, спостерігаючи під мікроскопом за розчиненням опадів дихлорида ртуті. Так як йод шкідливо впливає на багато барвники, його видаляють шляхом подальшої обробки зрізів (після 70% спирту) 0,25% розчином гіпосульфата до зникнення жовтуватого забарвлення. Потім проводять відмивання гіпосульфата в дистильованої воді.
Целлоідіновие зрізи можна фарбувати без попереднього видалення целлоидин. У цих випадках зрізи з 70% спирту (в якому їх зберігають або в який збирають в процесі різання) переносять в 50% спирт, а потім в дистильовану воду. Якщо застосовується барвник забарвлює целлоидин, то останній видаляють, помістивши зріз в один з розчинників целлоидин (суміш з рівних кількостей абсолютного спирту з ефіром, ацетоном, метиловим спиртом). Після розчинення целлоидин зріз обробляють так само, як при депарафінірованіі (спирти низхідній концентрації - вода).
Желатинові зрізи звільняють від желатину, поміщаючи в злегка підкислену дистильовану воду, підігріту до 37 ° С. Якщо блок піддавався додатковому ущільненню в формаліні, то видалити желатин неможливо, і це в ряді випадків може утруднити мікроскопірованіе.
Заморожені зрізи не потребують попередньої обробки, так як зазвичай при різанні їх збирають в дистильовану воду.
Попередній обробці і подальшої забарвленням можна піддавати як наклеєні на предметні скельця, так і вільно-плаваючі зрізи. У першому випадку вживають біологічні стаканчики, спеціальні кювети, високі бюкси. Для того щоб збільшити пропускну здатність, скла зі зрізами складають попарно стороною, що не несе зріз (спинкою), один до одного і мають у своєму розпорядженні у вигляді трикутника (рис. 78) або (в більш просторому посудині) укладають пари один за одним, розділяючи їх з допомогою різних пристосувань (вигнуті скляні або металеві пластинки і т. д.). Для роботи зі свободноплавающими зрізами застосовують вартові скла, низькі стаканчика чи чашечки. Чи не наклеєні зрізи переносять з одного посуду в іншу за допомогою скляного (або металевого) гачка або шпателя, а скла - пінцетом.
Мал. 78.
Розташування стекол зі зрізами в стаканчику.
Посуд має бути чітко етикетувати і розставлена в певному порядку, що забезпечує потрібну послідовність роботи.
Примітка. При перенесенні зрізів з одного розчину в інший необхідно стежити за тим, щоб наступна порція рідини якнайменше загрязнялась попередньої (особливо при переміщенні з ксилолу в спирт). Для цього при перенесенні предметних стекол і свободноплавающих зрізів намагаються забезпечити максимальне стікання рідини, стежачи одночасно за тим, щоб зріз НЕ підсох (висихання помітно по побілінню зрізу). Предметні скла, складені попарно, необхідно роз`єднати і швидко просушити зворотну сторону фільтрувальної папером або ганчіркою, стежачи за тим, щоб не переплутати сторони. Слід також бути уважним при опусканні і витяганні стекол зі зрізами, бо при цьому можна подряпати зрізи.
Необхідно своєчасно міняти розчини, не допускаючи їх надмірного забруднення.
Якщо зрізи в процесі подальшої обробки відклеюються від стекол (при застосуванні яскраво виражених кислих або лужних розчинів або недостатньо міцному приклеюванні), то це можна виправити, застосувавши целлоідіновую захист. Для цього зріз з води поміщають послідовно в 70% і 96% спирт, потім скло опускають в 0,5-1% розчин целлоидин, виймають, дають злегка підсохнути (не до повного висихання!) І поміщають в 70% спирт.
Мал. 79.
Пристосування для одномоментної обробки великої кількості стекол зі зрізами.
В результаті цих маніпуляцій зріз і прилеглі ділянки предметного скла покриваються тонкою целлоідіновой плівкою, завдяки якій і досягається зміцнення зрізу і на склі. Після цього зріз промивають в дистильованої воді і фарбують.
Проведення фарбування. При фарбуванні водними барвниками зрізи переносять з дистильованої води, а при фарбуванні спиртовими - зі спирту відповідної концентрації безпосередньо в фарбувальний розчин (пряме фарбування) або спочатку в рідину для протруєння (непряме фарбування). Коли препарат набуває потрібну інтенсивність забарвлення, його промивають у воді (або спирті) для видалення надлишку барвника, а потім, якщо потрібно, диференціюють у відповідній рідини. Зайвий барвник відмивають до тих пір, поки він не перестає переходити з зрізу в відмивати рідина.
Фарбування зрізів, наклеєних на скла, можна проводити шляхом як приміщення їх в фарбувальний розчин, так і наколювання барвника на зріз. У першому випадку застосовують скляні стаканчики, кювети або спеціальні металеві стійки, які дозволяють одночасно фарбувати велика кількість (до 40-50) стекол (рис. 79). Для фарбування наколюванням в плоскі чашки або ванночки кладуть паралельно скляні палички, на які укладають предметні скельця. Для того щоб палички не зміщувалися, кінці їх з`єднують гумовою трубкою. Після цього на зріз за допомогою піпетки накапують розчин
барвника. Якщо фарбування тривалий, то щоб уникнути випаровування барвника місце розташування зрізу накривають маленьким годинниковим склом або чашкою. Подібний ефект можна отримати, помістивши предметні скельця з накапати барвником в чашку Петрі, одночасно поклавши поруч змочену у воді вату. Після того як чашка буде закрита, відбувається зволоження повітря, що веде до значного зменшення випаровування барвника розчину. Фарбування свободноплавающих зрізів, як і при попередній підготовці, ведуть в бюксах або на часових стеклах.
