Просвітлення і висновок зрізів, висновок в смоли - основи гістології
Просвітлення і висновок зрізів
Для того щоб пофарбований препарат можна було дослідити в світлі і можливо довше зберігати, він повинен бути прозорим і захищений від висихання, забруднення і пошкодження.
Всі ці умови забезпечуються просвітленням і укладенням препарату в спеціальні середовища, які і зберігають його прозорість, забарвлення і структурну цілісність.
Середовища для укладення можна розділити на дві основні групи: а) змішуються з водою (гліцерин, гуміарабік, желатин) - б) смешивающиеся з водою (різні смоли). Речовини першої групи є одночасно прояснюючим і не вимагають зневоднення препарату, тоді як перед укладенням препарату в смоли, його необхідно ретельно збезводнити і просветлить в карболксілоле (толуол, бензол) або оптичних маслах (бергамотовое, каепутовое, гвоздикове і ін.). Незважаючи на те що методика укладання препаратів в безводні середовища (смоли) більш складна і підвищує вартість препарату, вона застосовується найбільш часто, так як має ряд важливих переваг перед методикою укладення в водні середовища. Основними з них є: високий ступінь прозорості препарату, тривале збереження його забарвлення і структур без змін, зручність зберігання. Найбільш поширеною смолою для укладення є бальзам (канадський або смерековий).
Висновок в смоли
Зневоднення (повне) препарату є обов`язковою попередньою умовою його укладення в смоли.
Для цього знаходиться в воді забарвлений препарат проводять через ряд спиртів зростаючої концентрації (60, 80, 96 і 100%).
Просвітлення препарату настає вже в процесі зневоднення, але, так як спирт не розчиняє бальзам, його необхідно видалити. Для цього препарат поміщають в один з розчинників бальзаму, який, видаляючи спирт, одночасно збільшує прозорість препарату. Найчастіше з цією метою застосовують ксилол, який може бути замінений толуолом або бензолом.
При обробці целлоідінових й не наклеєних желатинових заморожених зрізів слід 100% спирт замінювати карбол-ксилолом, так як абсолютний спирт викликає набухання перших і зморщування друге. Так як карбол-ксилол руйнує деякі барвники, перебування в ньому препаратів не повинно перевищувати 3-4 хв, після чого необхідно ретельно промити в двох порціях чистого ксилолу.
Для того щоб приготувати розчин карбол-ксилолу, потрібно розплавити в термостаті (при 56 ° С) кристалічну карболову кислоту і потім змішати її з ксилолом у співвідношенні 1: 4, 1: 6.
Слід пам`ятати, що карбол-ксилол порушує подвійне променезаломлення речовин, що знаходяться в тканинах, тому його не можна використовувати для поляризаційних досліджень.
Якщо необхідно уникнути застосування абсолютного спирту, крім карбол-ксилолу, можна використовувати оптичні масла (каепутовое, бергамотовое, гвоздикове). Після видалення надлишків спирту накапують масло, потім через 2-3 хв зріз промокають фільтрувальної (гладкою) папером і, повторивши подібну процедуру кілька разів, проводять його через ксилол (бензол, толуол).
Якщо потрібно виключити обробку препаратів спиртами малої фортеці (вимивання деяких барвників - забарвлення пикрофуксином і ін.), Предметне скло кладуть на фільтрувальну папір вгору препаратом і промокають зріз складеної в кілька разів гладкою * фільтрувальної папером, обережно накривши нею препарат і проводячи пальцем уздовж скла. Потім так само обережно видаляють фільтрувальну папір і поміщають препарат в 96% спирт. Подальшу обробку ведуть, як зазвичай.
* Фільтрувальний папір, що має шорстку поверхню, для цих цілей непридатна, оскільки забруднює препарат волоконцами.
Якщо препарат недостатньо звільнений від води, то при його зануренні в ксилол з`являється білувате помутніння. В цьому випадку препарат необхідно знову помістити в абсолютний спирт для остаточного зневоднення.
При перенесенні зрізів з однієї рідини в іншу необхідно, щоб наступна порція не забруднює попередньої. Особливо важливо дотримуватися цієї умови при перенесенні препаратів зі спирту в ксилол. Тому рідини дають гарненько стекти, а якщо скла складені попарно, їх обов`язково при цьому роз`єднують і витирають зворотну сторону фільтрувальної папером або ганчіркою. Однак не слід довго тримати зрізи на повітрі, так як вони при цьому підсихають (виникає побіління) і псуються.
Можна проводити зневоднення і просвітлення як свободноплавающих зрізів, так і наклеєних на стеклах. Однак при знаходженні свободноплавающих зрізів в міцних спиртах та карбол-ксилоле вони зморщуються, стають крихкими і погано розправляються при розміщенні на предметному склі. Тому там, де це можливо, свободноплавающие зрізи (желатинові, целлоідіновие і заморожені) необхідно наклеювати на предметне скло до зневоднення і просвітління. Для цього зріз переносять з води в 70% спирт, куди опускають предметне скло, на яке за допомогою пензлика (або голки) натягують зріз і розправляють. Після цього скло обережно виймають, видаляють фільтрувальної папером надлишок вологи навколо зрізу і потім сильно притискають гладкою фільтрувальної папером, змоченою 96% спиртом (можна попередньо змастити скло білок-гліцерином). Подальшу обробку ведуть, накапивая послідовно збезводнювальні і просвітлюють розчини, періодично промокаючи зрізи змоченою в спирті фільтрувальної папером. При цьому необхідно уникати висихання зрізів.
Обробка в біологічних стаканчиках зрізів, наклеєні х зазначеним вище способом, нерідко призводить до їх відшарування.
Висновок зрізів. Для зневоднених і просвітлених препаратів найбільш часто застосовується середовищем укладення є бальзам, що представляє собою прозору, жовтуватого кольору деревну смолу. Бальзам має консервуючими властивостями, зберігає прозорість препарату і має показник заломлення, близький до показників заломлення скла. В останньому властивості легко переконатися, поглянувши на скляну паличку, занурену в бальзам (частина, що знаходиться в смолі, майже не видно).
Розрізняють два види бальзаму - канадський і смерековий. Спосіб приготування їх однаковий: шматок (або шматки) затверділої смоли поміщають в чисту суху широкогорлую скляну банку і, заливши ксилолом (або толуолом), ставлять в термостат. Зазвичай готують розчин рідкої консистенції, який фільтрують і залишають у відкритому посуді (бажано в витяжній шафі). У міру випаровування розчинника бальзам починає загусати. Коли консистенція його буде нагадувати рідкий мед, розчин готовий до вживання.
Зазвичай бальзам має слабокислу реакцію. У тих випадках, коли кисле середовище діє на забарвлення несприятливо, необхідно застосовувати нейтральний бальзам, який отримують шляхом додавання невеликої кількості порошку карбонату калію або натрію. Зберігають бальзам в спеціальних широкогорлих склянках, що закриваються притертими ковпачками, шліф яких змащують тонким шаром вазеліну. Якщо немає спеціальної склянки, можна використовувати невеликий шірокогорлую флакон з-під ліків, що закривається еластичною хлорвінілової пробкою. У центрі пробки роблять отвір і вставляють в нього скляну паличку, за допомогою якої і витягають бальзам.
Методика. Вийнявши скло зі зрізом з ксилолу, швидко витирають тильну сторону і, поклавши в горизонтальному положенні на стіл (або будь-яку плоску підставку), наносять кілька крапель бальзаму. Потім беруть приготоване покривне скло (чистим пінцетом або обережно двома пальцями за бічні краї, щоб не забруднити поверхню), ставлять його на предметне скло поруч з препаратом під кутом 45 ° і, як тільки бальзам розтечеться по краю покривного скла, потихеньку опускають (рис. 80). При цьому повітря поступово витісняється і бальзам покриває препарат тонким, рівномірним шаром. Покривні скла потрібно підготувати заздалегідь. Крім того що вони повинні бути абсолютно чистими, їх слід розсортувати на товсті і тонкі. Якщо забарвлюваний препарат припускають досліджувати із застосуванням иммерсионного об`єктива, то його не можна укладати під товсте покривне скло, так як фокусна відстань об`єктива виявиться меншим, ніж загальна товщина укладеного препарату, і фокусування не буде досягнута.
Мал. 80.
Висновок зрізів під покривне скло.
Кількість бальзаму потрібно розраховувати таким чином, щоб його вистачило лише на покриття всієї площі під покривним склом. Якщо бальзаму мало, то залишиться вільний простір між стеклами, якщо багато, розчин розтечеться по предметному склу та забруднить його. У першому випадку потрібно нанести краплю бальзаму на предметне скло у того краю покривного скла, під яким залишилося повітря, і він заповнить порожнечу. Якщо бальзам витік з-під покривного скла, його потрібно відразу стерти ганчіркою, злегка змоченою в ксилолі. Ув`язнений препарат поміщають на спеціальний планшет і кладуть на покривне скло вантаж на 24 год для розправлення. Якщо потрібно сильно притиснути (значна нерівність поверхні препарату), то застосовують білизняні затиски. Препарат повинен перебувати в горизонтальному положенні не менше 24 ч. Після того як бальзам загусне, препарату можна надавати будь-яке положення.
Зберігання. Зберігати гістологічні препарати слід захищеними від пилу і світла. Найбільш доцільний спосіб - зберігання в спеціальних коробках з зубчастими рейками. Зберігання в папках менш зручно, тому що не виключає запилення і вимагає багато місця. Добре висушені препарати можна тримати і в звичайних картонних коробках (з-під цукерок, цигарок і т. Д.). У цих випадках скла складають попарно спинками і кожну пару відокремлюють від подальшої горизонтальної смужкою щільного паперу. Необхідні позначки роблять на зовнішній поверхні стінок коробок.
Можливі похибки при укладанні: а) весь препарат покритий дрібними пилоподібними крапельками (недостатнє зневоднення) - необхідно змінити розчини, збільшити час обезвожіванія- б) під склом різнокаліберні рухливі бульбашки (при укладенні потрапило повітря) - якщо бульбашки розташовані над препаратом і при легкому натисканні препаровальной голкою на покривне скло не зникають, необхідно переукласти препарат- для цього скло з препаратом занурюють в ксилол і тримають до тих пір, поки покривне скло сповзе сама чи легко піддасться зміщення препаровальной іглой- в) препарат перетинають безструктурні або зубчасті об`ємні волокна, на зрізі розташовані різні включення (забруднення препарату в процесі проведення через розчини, забруднений бальзам або ж погано очищено покривне скло) - фільтрують розчини, ретельно протирають покривні скла.
