Забарвлення - мікробіологія з технікою мікробіологічних досліджень

Для фарбування бактерій необхідно мати ряд фарбувальних розчинів, бажано в особливих склянках з піпетками, на які надіті гумові балончики. Фарбу за допомогою піпетки наливають на препарат так, щоб весь мазок був покритий нею. Препарат з фарбою поміщають на підставку для предметних стекол. Таку підставку кладуть на чашку або фотографічну ванночку (рис. 14). Якщо при фарбуванні необхідно підігрівання, то користуються спеціальним пінцетом для предметних стекол (рис. 15). Після закінчення фарбування фарбу змивають струменем води або препарат промивають в посудині з водою. Після промивання препарат залишають у вертикальному положенні для просушування або сушать між листками фільтрувального паперу. Якщо на препараті залишиться вода, то, з`єднавшись з іммерсійним маслом, вона дасть емульсію, що заважає хорошому баченню при мікроскопії.
фарби
Фарби, що застосовуються для бактеріологічних досліджень, відносяться до групи так званих анілінових. Але оскільки вони виходять не тільки з аніліну, а й з інших похідних кам`яновугільного дьогтю - бензолу, толуолу та ін., То правильніше називати їх кам`яновугільними фарбами. Фарби ці поділяються на основні і кислі. Терміни «кислі» та «основні» тільки визначають спорідненість фарби до певної частини клітини. Основними фарбами добре фарбуються ядра і мікроби. Кислі фарби забарвлюють мікробів слабкіше, при фарбуванні ж тканин вони забарвлюють цитоплазму клітин. Найбільш споживані наступні фарби: метиленовийсиній, метіонін (сині фарби), основний фуксин, сафранін і еозин (червоні фарби), бісмаркбраун, або везувін (коричнева фарба), метілгрюн (зелена фарба), метилвіолетом, генціанвіолет (фіолетові фарби). З них тільки еозин - кисла фарба. Вона вживається для деяких спеціальних цілей.
Всі ці фарби продаються у вигляді аморфних або кристалічних порошків, і з них вже готують фарбувальні розчини.
Приготування фарбувальних розчинів. Вихідним матеріалом майже для всіх необхідних робочих фарб є насичені спиртові розчини, які слід мати в запасі і зберігати в склянках з притертими пробками. Насичені спиртові розчини готують наступним чином: 10 г сухої фарби висипають у флакон з притертою пробкою, наливають 100 мл 96 ° спирту (ректифікату) і дають настоятися протягом декількох днів, кожен день збовтуючи розчин. З таких насичених розчинів готують спирто-водні паствори, придатні для забарвлення мікробів. Найбільш часто використовуються такі розчини.
Карболовий фуксин (фуксин Ціля)
10 мл насиченого спиртового розчину фуксину 100 мл 5% карболової кислоти
розведений фуксин
10 мл карболового фуксину 90 мл дистильованої води
Лужний метиленовийсиній 30 мл насиченого спиртового розчину синьою 100 мл дистильованої води 1 мл 1% розчину лугу
Карболовий генціанвіолет 10 мл насиченого спиртового розчину генціаівіолета 90 мл 5% карболової кислоти
Розчини генціаівіолета дають опади при фарбуванні. Замість генціаівіолета можна користуватися насиченими спиртовими розчинами метилвіолетом або крісталвіолета. Розчини карболової кислоти можна брати 1%, а не 5%. Крім того, для забарвлення по Граму можна користуватися 0,25% водним розчином метилвіолетом або крісталвіолета без карболової кислоти. Розчин стійкий і осаду не дає.
За методом Синьова замість розчину генціанвіолета застосовують шматочки фільтрувального паперу, попередньо просочені спиртовим розчином фарби і потім висушені. Для цього аркуші фільтрувального паперу занурюють на 1-2 хвилини в 1-2% розчин фарби в 96 ° спирту, після чого папір висушують на простягнутою мотузочці або скляних паличках і розрізають на шматочки 2X4 см. Такі папірці зберігаються в банках з притертою пробкою необмежений час .
Прості методи забарвлення мікробів. У лабораторній техніці користуються простими і складними методами забарвлення мікробів. Простим методом забарвлення називають забарвлення препарату однієї якої-небудь фарбою. До таких методів відноситься забарвлення розведеним фуксином або лужної метиленової синьої.
Забарвлення розведеним фуксином. На предметному склі готують мазок і фіксують його на полум`ї пальника. Потім на охолоджений препарат на 1-2 хвилин наливають розведений фуксин. Фарбу змивають водою і препарат висушують.
Забарвлення лужним метиленовим синім (Леффлера). На предметному склі готують мазок і фіксують його на вогні. На остиглий мазок наливають метиленовим синь на 2-3 хвилини. Фарбу змивають водою і препарат висушують. При фарбуванні диференціюється ядро і цитоплазма, і тому при фарбуванні патологічного матеріалу (гній, ексудат і т. Д.) Доцільніше використовувати метиленовийсиній.
Складні методи забарвлення мікробів. При складних методах забарвлення мікробів на один і той же препарат впливають декількома розчинами барвників. Складні методи засновані на фізико-хімічному будову бактеріальної клітини і спорідненості мікробів до певних фарб. Ці методи забарвлення мають важливе значення при диференціації мікробів. До складних методів відноситься забарвлення по Граму, Цілем - Нільсеном, Нейссеру і т. Д.
Забарвлення мікробів за Грамом. Всі мікроби по їх відношенню до фарбування за Грамом діляться на дві групи: а) грампозитивні, або грамположітельние- б) грамнегативні, або грамнегативні.
Різне ставлення до фарбування за Грамом залежить від відмінностей у фізичному і хімічному будову самих бактерій. Для забарвлення за класичним методом Грама необхідні наступні розчини:

1. карболовий генціанвіолет;
2. розчин Люголя (йоду кристалічного 1 г, йодистого калію 2 г і дистильованої води 300 мл-йод і йодистий калій змішують і розчиняють в 5 мл води, а потім додають решту води);
3. спирт 96 °;
4. розведений фуксин.

Техніка забарвлення за Грамом. На фіксований мазок кладуть фільтрувальний папір, за розміром дорівнює зробленому мазку. На цей папір наливають розчин генціанвіолета на I-2 хвилини. Зливають фарбу з папером і, не промиваючи препарат водою, наливають на 1 2 хвилини розчин Люголя до почорніння мазка. Потім розчин Люголя зливають і на 1 / 3-1 хвилину наливають 96 ° спирт (при цьому препарат треба похитувати). Промивають водою і додатково фарбують розведеним фуксином (1-2 хвилини). Зливають фарбу, промивають водою, висушують і мікроскопують.
Видозмінений спосіб Грама (по А. Синяву). l.Ha фіксований мазок накладають смужку фільтрувального паперу, просочену 1% спиртовим розчином крісталвіолета або генціанвіолета.

1. Наносять на папір 2-3 краплі води і залишають на 2 хвилини.
2. Знімають папір пінцетом і наливають розчин Люголя на 1-2 хвилини.
3. Знебарвлюють спиртом (10-30 секунд).
4. Додатково фарбують розведеним фуксином (1-2 хвилини). _

Механізм забарвлення по Граму. Суть методу Грама полягає в тому, що фарба генціан-, метил або крісталвіолет має здатність міцно фіксуватися в бактеріальної клітці. В цьому випадку під дією спирту не настає знебарвлення, мікроб залишається забарвленим в фіолетовий колір. Це означає, що він грампозитивний. Якщо ж в бактеріальної клітці фарба не буде фіксована, то під дією спирту мікроби знебарвлюються і сприймають додаткову фарбу - розведений фуксин. Мікроби фарбуються в рожевий колір, т. Е. Вони будуть грамнегативні (рис. 16 на вклейці).
Забарвлення кислотостійких бактерій. Способи забарвлення кислотостійких бактерій засновані на їх здатності забарвлюватися лише сильно фарбувальними розчинами фарб при нагріванні. При наступному дії слабких кислот вони не знебарвлюються. Завдяки такій обробці кислотостійкі мікроби можуть бути диференційовані від інших бактерій. Найбільш споживані забарвлення за Цілем - Нільсеном.
Техніка забарвлення. 1. На фіксований мазок кладуть шматочок фільтрувального паперу, на яку наносять карболовий фуксин, і препарат фарбують при нагріванні до триразового появи парів, після чого залишають фарбу ще на кілька хвилин і дають препарату охолонути.

Мал. 16. Забарвлення по Граму стафілокока і вібріона.

1. Зливають фарбу і промивають препарат водою. , 3 знебарвлюється 5% розчином сірчаної кислоти (10-30 секунд).
2. Промивають водою.
3. Промивають чистим спиртом 10-15 секунд.

6. Спирт змивають водою.
7. дофарбовував синью Леффлера протягом 3-5 хвилин.

Знебарвлення препарату можна також зробити 3% розчином солянокислого спирту. При цьому методі забарвлення кислотостійкі туберкульозні бактерії забарвлюються в рубіново-червоний колір, а інші, некіслотоустойчівие мікроби, - в синій колір (див. Рис. 88 на вклейці).
Кислотно-і спиртостійкі туберкульозних мікобактерій пояснюється тим, що вони мають в своєму складі міколових кислоту, яка набирає хімічна сполука з карболовим фуксином. Це з`єднання фіксує фарбу в мікробної клітці, і тому палички не знебарвлюються.
Забарвлення суперечка. У мікробіологічній практиці застосовують кілька методів забарвлення суперечка (рис. 17 на вклейці).

1. Спосіб Пєшкова. На краю предметного скла роблять тонкий мазок з культури бактерій, просушують на повітрі і фіксують спирт-ефіром, спирт-формаліном або па полум`я пальника. На фіксований препарат наливають синь Леффлера і на полум`ї пальника доводять до кипіння протягом 15-20 секунд. Дають препарату охолонути, промивають водою і дофарбовують 0,5% водним розчином нейтральрота 30-60 секунд. Фарбу промивають і препарат висушують. Спори фарбуються в блакитний або синій колір, вегетативні форми - в рожевий.
2. Спосіб Гансена. Препарат фіксують на полум`ї пальника 5-7 разів, на фіксований препарат кладуть шматочок фільтрувального паперу, на яку наносять карболовий фуксин, і на полум`ї пальника доводять до кипіння. Препарату дають злегка охолонути, доливають карболовий фуксин і знову кип`ятять. Потім, долив карболовий фуксин, кип`ятять втретє. Препарату дають охолонути, промивають водою, знебарвлюють 5% розчином сірчаної кислоти протягом 20-30 секунд і дофарбовують синью протягом 3-5 хвилин. Спори, стійко фарбувати фуксином, - червоні, а вегетативні тіла бактерій, знебарвила в результаті впливу сірчаної кислоти, фарбуються метиленовим синім в синій колір (див. Рис. 101 на вклейці).

Мал. 18. Капсули у пневмокока.


Мал. 17. Спори бацил.

Мал. 19. Капсули у бактерій.

Забарвлення капсул. Забарвлення капсул вдається за допомогою звичайних фарб, метиленової синьої або розведеним фуксином, причому найкраще в мазках з органів або тканинної рідини (рис. 18 на вклейці). У цих випадках тіла мікробів і фон (клітини органу) пофарбовані в синій або червоний колір, капсула ж видно як безбарвна облямівка, навколишнє мікроб.
Метод Гінса. При фарбуванні капсул в чистій культурі мікробів користуються методом Гінса.
Техніка забарвлення. 1. На предметне скло наносять краплю креслярської туші і розбавляють рівною кількістю води.

1. В отриману краплю вносять невелику кількість агаровой або бульонной культури бактерій і змішують петлею.
2. Ребром шліфувального скла стосуються краплі туші і, коли туш розтікається по ребру скла, роблять мазок, як мазок з крові.
3. Мазок фіксують в концентрованому розчині сулеми 1 хвилину або на полум`ї пальника.
4. Промивають водою (при фіксації в сулеме).
5. Фарбують карболовим фуксином або синью 5-10 хвилин.
6. Змивають водою, сушать і микроскопируют.

Капсули не фарбуються, але завдяки застосуванню туші представляються різко окресленими, тіла ж бактерій пофарбовані і лежать всередині капсули (рис. 19, на вклейці).
Забарвлення метахроматичні зерен (волютина) по Нейссеру. Необхідно приготувати дві фарби: а) уксуснокислую синь Нейссера, б) фарбу везувін, або бісмаркбраун.
Синь Нейссера складається з двох розчинів:
розчин А
Метиленовогосинього 0,1 г Етилового спирту 2 мл Крижаний оцтової кислоти 5 мл дистильованої води 100 мл
розчин Б
Крісталвіолета 1 г
Етилового спирту (абсолютного) 10 мл дистильованої води 300 мл
Розчини А і Б змішують безпосередньо перед фарбуванням у відношенні 2: 1.
Фарба везувін, або бісмаркбраун, виходить шляхом розчинення 1 г порошку в 300 мл киплячої дистильованої води.
Техніка забарвлення. На фіксований препарат наносять синьку Нейссера на 0,5-1 хвилину, фарбу змивають водою і додатково забарвлюють розчином везувіна 1-3 хвилини. Після цього препарат промивають водою, сушать і микроскопируют. За цим способом бактерії забарвлюються в світло-коричневий колір, а метахроматичні зерна - в синій (рис. 83 на вклейці).
У деяких лабораторіях наведений класичний метод Нейссера кілька видозмінюють. Уксуснокислую синь наносять на 4-5 хвилин, промивають водою. Потім на препарат наливають на V2-1 хвилину розчин Люголя, зливають його і дофарбовують везувіном протягом 1-V2 хвилини.
Забарвлення за Романовським-Гімзою. Фарба Гимзи - суміш Азура (органічна фарба, що одержується з метиленовогосинього), еозину і метиленової сині. Будучи в розчині синього кольору, вона забарвлює клітинну цитоплазму в блакитний колір, а ядра клітин, зернистість, слиз, капсули бактерій - в червоно-фіолетовий колір.
Забарвлення за Романовським-Гімзою є одним з основних методів при вивченні морфології найпростіших, спірохет, а також при дослідженні формених елементів крові.
Спосіб застосування. До 10 мл дистильованої води нейтральною або слаболужною реакції безпосередньо перед фарбуванням препарату додають 10 крапель фарби і негайно ж наливають на фіксований препарат (або занурюють препарат в стаканчик з фарбою). Через 1 годину фарбу зливають, препарат промивають водою, висушують на повітрі і досліджують. Якщо помістити препарат з фарбою в термостат при 37 °, то фарбування відбувається швидше (30-40 хвилин). Результати фарбування залежать від властивостей води, тому слід перевіряти її реакцію.
Забарвлення риккетсий по Здродовського. Тонкий мазок фіксують на полум`ї пальника. Фарбування роблять розведеним карболовим фуксином (10-15 крапель фуксину на 10 мл бидистиллированной води) протягом 5 хвилин. Пофарбований препарат промивають водою, а потім знебарвлюють в розчині органічної або мінеральної кислоти (0,5% лимонна кислота, 0,01% соляна кислота) протягом 2-3 секунд. Потім препарат промивають водою і дофарбовують 0,5% розчином метиленової сині протягом 1/3 хвилини. У препараті на синьому тлі будуть видні пофарбовані в червоний колір рикетсії (рис. 116 на вклейці).

Дослідження мікроорганізмів в живому стані

Так як методи виявлення джгутиків важкі, а визначення рухливості мікробів служить цілям визначення їх виду, то в повсякденному лабораторній практиці для визначення рухливості користуються наглядом бактерій в живому стані - в роздавленою або висячої краплі.
Роздавлена крапля. На середину предметного скла наносять петлею або піпеткою краплю досліджуваного матеріалу. Цю краплю накривають покривним склом, обережно накладаючи його пінцетом, щоб в рідини не утворилося повітряних бульбашок. Правильно зроблена крапля заповнює весь простір між покривним і предметним склом, але при цьому рідина не виступає за краї покривного скла. Якщо потрібно розглядати препарат тривалий час, то краю покривного скла попередньо змащують вазеліном.
Висяча крапля. Краплю досліджуваного матеріалу наносять на середину покривного скла. Потім покривне скло швидко повертають краплею вниз і накладають на предметне скло з поглибленням ( «лункою») в середині. Крапля повинна вільно звисати в поглиблення, не стикаючись з його дном і краями (рис. 20). Краї виїмки на предметному склі слід попередньо змастити вазеліном. Таким чином, крапля виявляється герметично закритій у вологій камері і захищеною від висихання.
Визначення рухливості у бактерій використовується при лабораторній діагностиці дизентерії, холери, черевного тифу та інших захворювань.
При дослідженні живих мікробів слід відрізняти активну рухливість бактерій, що свідчить про наявність у них невидимих джгутиків, від пасивного молекулярного (броунівського) руху, властивого всім зваженим в рідини дрібним часткам (формені елементи, зернятка, порошинки, мікроби як позбавлені джгутиків, так і вбиті) .

Мал. 20. Висяча крапля.

Дослідження в темному полі зору. Рух бактерій і спірохет можна спостерігати в мікроскопі, який відрізняється від звичайного застосуванням яскравого бокового освітлення, в силу чого виходить зображення світиться об`єкта на темному тлі. Принцип темного поля заснований на тому, що падаючі збоку світлові промені відхиляються щільними частинками (зокрема, бактеріями) і останні завдяки цьому представляються ока спостерігача яскраво світяться. Бічне освітлення в мікроскопі можна отримати, замінивши звичайний освітлювач спеціальним конденсором з затемненням в центрі. Такий конденсор затримує всі центральні промені світла і пропускає лише периферичні. Техніка дослідження полягає в наступному. На предметне скло наносять краплю досліджуваного матеріалу і обережно накривають покривним склом, щоб не було бульбашок повітря. Потім на поверхню конденсора поміщають краплю води або кедрової олії і предметне скло з препаратом кладуть на цю краплю.

Відео: цитологія-2: забарвлення препаратів