Вивчення раку, викликаного кам`яновугільної смолою - рак: експерименти і гіпотези

Перший крок: вивчення раку, що викликається кам`яновугільної смолою
Виявити витоки науки в багатьох випадках досить важко. Це складно зробити навіть при вивченні історії експериментальних досліджень раку, однак, мабуть, слід все ж виділити як особливу дату 1775 рік: саме тоді французький лікар Бернар Пейрійе прищепив собакам пухлини людини і викликав нові «розростання». Академія наук і образотворчих мистецтв в Ліоні нагородила дослідника першою премією за участь в конкурсі робіт з вивчення «причин вірусу раку». Однак і старанний лікар, і академія стали жертвами омани: розростання були істинними пухлинами, а лише гнойнікамі- запальні набряки важко було відрізнити від злоякісних пухлин без мікроскопа і відповідної бактеріологічної техніки.
У тому ж році англійський лікар Персіваль Потт опублікував повідомлення про рак мошонки у сажотрусів. Ці хворі ще в дитячому віці змушені були лазити по вузьких димоходів і очищати їх від скопилася кіптяви. Потт прийшов до висновку, що має справу із злоякісними пухлинами, і, таким чином, був першим, хто поставив діагноз раку як професійного захворювання. Більш того, він документально довів, що рак може бути викликаний зовнішнім впливом. «Причинним агентом» в вивченому їм випадку, мабуть, була сажа, тобто найдрібніші частинки вугільного пилу, злипаються завдяки кам`яновугільної смоли.
Через 100 років після Потта німецький лікар Фолькманна виявив, що кам`яновугільна смола і сама по собі здатна викликати рак. Обстежуючи робочих, зайнятих на виробництві смоли, він встановив, що рак виникав головним чином на шкірі кистей рук і передпліч. Але протягом майже півтора століття після Потта нікому не вдалося викликати рак у тварин. І лише в 1915 р
японські вчені Ямагіва і Ішикава повідомили про те, що индуцировали справжні пухлини, завдаючи кам`яновугільну смолу на шкіру вух кролика. І хоча критики і заздрісники вважають це повідомлення лише подальшим підтвердженням добре відомого факту, по суті японські вчені зробили перший крок в експериментальних дослідженнях злоякісних пухлин.

Експериментальні дослідження пухлин до Ямагіва

Раніше було відомо, як трансплантувати спонтанні пухлини відповідним тваринам-реципієнтам, і вчені приступили до досліджень властивостей і поведінки «штучних» пухлин. Деякі з перших перевіваемих пухлин, зокрема саркома Єнсена, до сих пір служать тест-об`єктами в багатьох інститутах, де ведуться дослідження раку. Однак в основному всі ці пухлини належать до числа спонтанних- вони виникають самостійно у тварини і далі можуть рости не тільки у того тваринного, у якого виникли, але також у будь-якої кількості тварин, яким будуть перевиті. Іншими словами, їх можна розглядати як живі препарати з патологічного музею, а не як репрезентативні приклади пухлинного росту. Допомогти у вирішенні питання, як і чому виникає пухлина, вони не можуть.
А тим часом саме це питання займав розуми багатьох патологів минулого століття. Серед спроб дати пояснення цього процесу слід виділити наступні:

1.  Вірхов в своїй роботі &lsquo-&lsquo-Die krankhaften Geschwiilste&rdquo- (1863) наполягав на тому, що рак в кінцевому підсумку виникає в результаті роздратування- при цьому він посилався на випадки, описані Потті.
2.  Конгейм і Рібберт постулювали, що в організмі зберігаються залишки ембріональної тканини, які можуть послужити причиною виникнення злоякісної пухлини.
3.  І нарешті, багато вчених припускали, що пухлини викликаються паразитами.

Фольке Хеншо, шведський патологоанатом і свідок описуваних подій, у своїй лекції, присвяченій пам`яті Ямагіва, так описував загальне настрій: «Бурхливий прогрес в мікробіології до кінця XIX в. спонукав багатьох вчених шукати причину всіх типів раку в інфекції бактеріями, грибками, водоростями і найпростішими або ж в інвазії тваринами паразитами різної природи ... Я добре пам`ятаю, як в Парижі старий французький вчений Боррель відвів мене в сторону, сподіваючись переконати в значенні аскарид як канцерогенного фактора ... Незабаром первісна паразитарна гіпотеза була забута, проте потім вона відродилася знову, але цього разу, як ми знаємо, в образі вірусної гіпотези ».
Цього відродження не довелося довго чекати: перші вірусні пухлини були відкриті вже з 1908 і в 1910 рр., Але офіційна наука, що займається дослідженнями раку, не надала цьому значення.
На порозі цього століття особливий успіх випав на долю гіпотези Конгейма - Рібберта: &bdquo-Мені доводилося чути, як патологоанатоми дещо зверхньо висловлювалися про «старої» теорії роздратування Вирхова як про теорію, що відійшла в минуле&rdquo-.
Тим часом теорія роздратування Вирхова послужила стимулом до численних спроб дослідників викликати рак експериментально шляхом використання «зовнішнього подразника». Спроби виявилися безуспішними. «Всі ці невдачі створили у багатьох капітулянтського настрій, - підсумовував Хеншен.- Здавалося, що рак так і не вдасться осягнути».
У цих умовах неважко собі уявити, з яким полегшенням зустріли вчені в 1915 р повідомлення Ямагіва і Ішикави «Експериментальне дослідження атипові епітеліальної проліферації».

Ямагіва і Ішикава індукують перші експериментальні пухлини

Обидва японських вчених вдалися до надзвичайно простий метод: два-три рази на тиждень скляною паличкою вони наносили кам`яновугільну смолу на внутрішню частину вуха кролика. У місці змазування смолою лише через три місяці виникли бородавчасті розростання. Потім ці розростання збільшилися і в кінці кінців майже повністю перетворили вухо тварини в ракову пухлину.
Удача і терпіння зіграли тут рівну роль: тільки тривалий нанесення кам`яновугільної смоли дозволило вченим індукувати папіломи і карциноми. Але використовуй вони в своїх дослідах собак або морських свинок, навіть воістину нелюдське терпіння не дало б результатів.
Незабаром з`ясувалося, що просте змазування спинок мишей також призводить до утворення пухлин - доброякісних і злоякісних. Це відкриття істотно полегшило роботу експериментаторів: адже миші набагато менше кроликів і утримувати їх легше, що дозволяє використовувати більшу кількість тварин. Крім того, значно скорочувалася час, потрібний для виникнення пухлини. Все, разом узяте, призвело до того, що миші стали стандартними тваринами у вивченні рака- Національний інститут раку в США навіть стали іноді жартома називати «Національним мишачим інститутом».
Наступне питання, яке стало перед вченими, напрошувався сам собою: які ж речовини в смолі є справжнім індуктором пухлин? Незважаючи на те що миші представляли собою «зручний» експериментальний матеріал, здавалося, що до цього питання не можна підступитися, бо хімія смол перебувала ще в зародковому стані, і в основному було відомо, що смола є сумішшю великого числа різних речовин. На жаль, труднощі полягали не тільки в цьому: для того щоб вивчити канцерогенні властивості частково очищених фракцій смоли, доводилося чекати місяцями, перш ніж зробити висновок про те, чи є дана фракція активною. Та й сам процес багатоступеневої очистки, яка зазвичай використовується при вивченні складних сумішей, неймовірно трудомісткий.

Кілька грамів 3,4-бензпірен з 2 т смоли

Незважаючи на зазначені труднощі, англійці Кук, Хьюітт і Хайджер зробили спробу виділити чистий канцероген з кам`яновугільної смоли. Крім терпіння, ці вчені мали і сміливістю: не покладаючись на біологічні тести, які вимагали б місяців очікування, вони використовували фізико-хімічні характеристики. Вже тоді було відомо, що всі вивчені смоли мають однаковий спектр флуоресценції. Ця обставина набуло особливого значення, коли з`ясувалося, що майже такий же спектр має і чисте з`єднання -

7,12 - ДІМЕТІЛБЕНЗАНТРАЦЕН	Антрацит
3,4 бензпірен	1,2 - бензпірен
1,2: 5,6 - дибензантрацен	1,2: 3,4 - дибензантрацен
3-метилхолантрен	Хріза
ПОМІРНІ І сильний канцероген	СЛАБОКАНЦЕРОГЕННИЕ АБО НЕАКТИВНІ
поліциклічні	ВУГЛЕВОДНІ

1. бензантрацен. Тому англійські вчені могли розраховувати на те, що їм вдасться виділити чисте з`єднання, яке в разі великого везіння виявиться канцерогеном.

На газовому заводі на прохання Кука піддали фракційної перегонці 2 т смоли. Після багаторазової перегонки, кристалізації і приготування характерних похідних вченим вдалося виділити 50 г (вихід 2,5 • 10 ~ 6%!) Якогось їм не відомого з`єднання. Це був 3,4-бензпірен, який, як було встановлено біологічними тестами, виявився цілком придатним для досліджень канцерогеном.
Але 3,4-бензпірен не відноситься до числа найперших чистих канцерогенів. У 1929 р Кук вже синтезував 1,2,5,6-дибензантрацен (ДВА), який також виявився активним канцерогеном.
Обидва з`єднання - і 3,4-бензпірен і 1,2,5,6-дибензантрацен - належать до класу поліциклічних вуглеводнів. Представники цього класу містять в якості основного будівельного блоку бензольні кільця, які можуть бути об`єднані в багаточленні кільцеві системи в різних поєднаннях (фіг. 3).

Поліциклічні вуглеводні здатні викликати пухлини не тільки на шкірі

Одноразова підшкірна ін`єкція 7,12-діметілбензан- трации (ДМБА), 3,4-бензпірен (БП) і інших канцерогенних вуглеводнів веде після досить тривалого латентного періоду (3-4 місяці, в залежності від дози) до розвитку саркоми. У цих дослідах щури виявилися значно більш чутливими, ніж миші.
При підшкірному введенні ДМБА щойно народженим мишам виникають численні лімфоми (пухлини лімфатичних залоз), а звичайні саркоми в місці введення виявляються рідко. У мишей пухлини яєчників утворюються в тих випадках, якщо їм згодовують ДМБА, вводять його внутрибрюшинно або просто змащують спіну- у щурів ж така обробка викликає рак молочної залози. Як у щурів, так і у мишей багаторазове внутрішньовенне введення ДМБА, крім того, веде до розвитку різних лейкозів. Після згодовування БП спостерігаються пухлини шлунка і легень, а також лейкози. У хом`ячків після нанесення на шкіру ДМБА виникають злоякісні меланоми (пухлини з меланоцитів - клітин, що синтезують пігмент).
Як ні парадоксально, поліциклічні вуглеводні здатні і пригнічувати розвиток раку: так, 3-метилхолантрен (MX) блокує експериментальне індукування пухлин печінки З-метил-4-диметиламіноазобензолу і 2-флуоренілацетамідом. Міллер і Міллер, детально вивчаючи цей ефект, встановили, що MX індукує ферменти в печінці, які, мабуть, перетворюють ці канцерогенні аміни в неактивні похідні.
Подібно до багатьох канцерогенів, поліциклічні вуглеводні токсичні: занадто велика доза вбиває піддослідних тварин. Але навіть у тих, хто вижив тварин часто помітний токсичний ефект: некротичні ділянки на шкірі в місці нанесення, некроз кори надниркової залози. Можливо, що токсичний ефект відіграє важливу роль і в канцерогенезі, але до цього питання ми ще повернемося.

Теоріїхімічної механізму канцерогенезу, що викликається вуглеводнями

З великого числа відомих поліциклічних вуглеводнів лише деякі є канцерогенами. Сам бензол, нафталін, антрацен і фенантрен НЕ канцерогенні. Що ж стосується 3,4-бензпірен і 1,2,5,6-дибензантрацен, Td4 вони досить сильні канцерогени. (3,4-БП відіграє особливу роль в навколишньому середовищі: залишки згоряння нафти, вихлопні гази, пил на вулицях, свіжа земля в поле, дим сигарет і навіть копчені продукти містять в деяких випадках значну кількість цього канцерогенного вуглеводню.) Як не дивно , 1.2-бензпірен і 1,2,3,4-бензантрацен, структурно дуже схожі з цими двома з`єднаннями, не є канцерогенами (див. фіг. 3). Заміщені вуглеводні - 3-МХ, ДМБА і 9,10-діметілантрацен - особливо активні, тоді як 1,2-бензантрацен вельми мало активний, а антрацит, як ми вже відзначали, і зовсім неактивний.
Чим же викликані ці відмінності? Цілком можливо, що неоднаковий хімічної активністю цих сполук. Іншими словами, хімічно активні речовини можуть бути канцерогенами. Основні типи реакцій, які слід розглянути, - реакції приєднання і замещенія- реакції приєднання особливо важливі для пояснення природи канцерогенної активності. Як приклад розглянемо реакцію поліциклічних вуглеводнів з чотириокисом осмію:

Механізм реакції повністю не вивчений, але для спрощення можна сказати, що наявна в цьому з`єднанні подвійний зв`язок забезпечує початок реакції. Подвійні зв`язку, які вступають в реакцію легше, ніж інші аналогічні зв`язку в даному з`єднанні, часто називають «К-районами». Наведена нижче таблиця підтверджує гіпотезу про те, що хімічна і канцерогенна активність корелюють один з одним (табл. 1).
Таблиця 1
Реакція приєднання в К-районі і канцерогенна активність

Правда, обмеженість такого простого порівняння кидається в очі: 1,2-бензантрацен, будучи вельми активним, проте не володіє канцерогенною активністю. І все ж думка про зв`язку хімічної та канцерогенної активності не слід відкидати. Потрібно враховувати, що швидкість зв`язування чотириокису осмію відображає лише частину широкого спектра можливих хімічних реакцій, в які може вступати дане з`єднання.
У теорії Пульмана, наприклад, дається істотне доповнення по так званим Л-районам (тобто районам з активними атомами, що знаходяться в пара-положенні):
відповідно до теорії, тільки комбінація «активного К-району» з «неактивним JI-районом» забезпечує з`єднанню здатність викликати пухлини.
Останнім часом ідея про те, що епоксід1 канцерогенного вуглеводню може виявитися необхідної проміжної хімічно активною формою, набула широкого поширення (Сімс, Гельбойн, Хайдельбергер). Такі епоксиди є більш ефективні трансформують агенти в тканинних культурах, ніж вуглеводні, з яких вони утворюються, і в той же час вони in vivo не більше ефективні. Незважаючи на складність проблеми, вивчення епоксидів, мабуть, виявиться найбільш багатообіцяючим підходом до з`ясування хімічно активних форм вуглеводнів.
Хоча безпосереднє визначення хімічної активності багатьох можливих проміжних хімічних продуктів здається привабливим, це непрактично. Розрахунки хвильової механіки за допомогою олівця, паперу або обчислювальної машини дозволяють обчислювати параметри, які якісно характеризують відповідну хімічну активність досліджуваного вуглеводню. Ці розрахунки отримали назву «хвильової» теоріїхімічної канцерогенезу. Однак в кожному окремому випадку ми лише постулюючи, що для канцерогенезу необхідний даний тип хімічної реакції, і намагаємося зв`язати канцерогенну активність з підказаної розрахунками можливістю хімічної сполуки вступати в цю реакцію.

Поліциклічні вуглеводні зв`язуються білками

В ультрафіолетовому світлі поліциклічні вуглеводні дають сильну флуоресценцію від біло-блакитний до біло-жовтого. Використовуючи цей високочутливий метод визначення, Е. Міллер в 1951 р прийшов до висновку, що 3,4-бензпірен в шкірі миші зв`язується білками. Його досліди були продовженням попередніх експериментів, в яких вдалося виявити зв`язування канцерогенних азобарвників білками печінки (див. Стор. 55). Очевидно, канцерогени зв`язуються білками саме того органу, в якому вони індукують пухлина.
занісь двухатомного спирту. - Прим. перев.
Хайдельбергер продовжив експерименти, користуючись радіоактивними вуглеводнями. Отримані результати на перший погляд виявилися такими, що розчаровують: розчинними білками шкіри пов`язувалися не тільки канцерогенні, а й неканцерогенними вуглеводні. Це означало, що реакцію зв`язування канцерогену білками можна вважати неодмінною умовою канцерогенезі. Однак нові досліди ще раз пробудили інтерес до «зв`язування білками»: Абель і Хайдельбергер розділили розчинні білки шкіри миші за допомогою електрофорезу в крохмальної гелі і виявили, що канцерогенні вуглеводні переважно зв`язувалися певної фракцією слабоосновних білків, в той час як неканцерогенними з`єднання зв`язувалися великим числом різних фракцій.
Проведені досліди дозволили істотно розширити хімічну теорію виникнення пухлин: очевидно, що важлива не тільки хімічна активність канцерогену, а й хімічна активність його партнера по реакції, в даному випадку певного класу білків.

Білки можуть бути регуляторами росту

Міллери вже висловлювали припущення, що азокрасители зв`язуються не всякими білками, а лише тими, які регулюють ріст. Прийнявши цю гіпотезу за основу, ми можемо побудувати дуже просту модель ракової клітини: втрата речовини, що регулює зростання, автоматично викликає неконтрольовані ділення клітини. Канцерогени дезактивують «регуляторні» білки останні в свою чергу не можуть бути замінені. Так виникають пухлинні клітини, в яких ці білки постійно відсутні. Ще 20 років тому подібне пояснення ні у кого не могло викликати здивування, оскільки в той час багато хто вважав, що саме білки відповідальні за власне відтворення (білкова матриця в синтезі білка). Однак, на думку сучасних вчених - думку, по суті став догмою, - за відтворення специфічної структури білків відповідальні нуклеїнові кислоти. Тим самим білки виявилися спущеними на другий рівень в клітинної ієрархії. Але в такому разі чому б канцерогенів не реагувати з нуклеїновими кислотами, особливо з ДНК?

Поліциклічні вуглеводні реагують і з ДНК

Тривалий час дослідникам не вдавалося продемонструвати зв`язування канцерогенних вуглеводнів з ДНК в шкірі миші. Пояснювалося це досить просто: зв`язування підлягає відносно невелике число молекул, які можуть бути виявлені лише за допомогою з`єднань, що володіють високою радіоактивністю. Але навіть в цьому випадку слід вкрай ретельно проводити процедуру вимірювання, щоб виявити надзвичайно низький рівень випромінювання.
Брукс і Лоулі першими остаточно довели, що поліциклічні вуглеводні зв`язуються ДНК. Крім того, вони виявили, що зв`язування і канцерогенна активність корелюють один з одним, хоча гошма і Хайдельбергер не змогли в повній мірі відтворити зазначену кореляцію. На реакції зв`язування канцерогену ДНК ми зупинимося в спеціальному розділі (стор. 238), оскільки вона вимагає докладного обговорення. А зараз звернемося до іншого класу хімічних канцерогенів - ароматичних амінів.

висновок

Перші експериментальні пухлини за допомогою хімічної речовини викликали Ямагіва і Ішикава (рак у кроликів, спровокований кам`яновугільної смолою, 1915 г.). Було показано, що основним канцерогенним фактором смоли є поліциклічні вуглеводні, серед яких знаходяться добре відомі 3,4-бензпірен і 3-метилхолантрен. Але не всі поліциклічні вуглеводні мають канцерогенну актівностью- невеликі зміни в структурі молекули здатні пригнічувати канцерогенну активність (пор. 3,4-бензпірен і 1,2-бензпірен).
Були зроблені також спроби встановити зв`язок між канцерогенної і хімічну активність цих вуглеводнів. Однак, крім хімічної активності, слід брати до уваги і реакційну здатність партнера по реакції-такими потенційними партнерами можуть бути білок, РНК і ДНК.
Які компоненти смоли викликають рак, відомо досить добре, але як вони це роблять, далеко не ясно.