Канцерогенні ароматичні аміни зв`язуються білками - рак: експерименти і гіпотези
Канцерогенні ароматичні аміни зв`язуються білками
Взаємодія МАБ з метіоніном свідчить одночасно і про зв`язуванні азобарвників білками, але історично склалося так, що до цього висновку вчені прийшли не відразу. Ще в 1947 р Міллери виявили, що білок печінки щура, якій згодовували ДАБ, в кислому середовищі рожевіє, а в лужному знову знаходить жовтий колір. Це фарбування не зникало після екстрагування органічними растворітелямі- барвник відмивали, залишаючись, втім, пов`язаним з амінокислотами лише після перетравлення білка протеолітичнимиферментами або після гідролізу гарячої лугом. Різні барвники володіють різною інтенсивністю зв`язування. Так, 3-метил-ДАБ зв`язується набагато краще, ніж ДАБ, а останній в свою чергу зв`язується набагато краще, ніж АБ. Це відкриття спричинило постановку двох суттєвих питань: яка хімічна природа зв`язування і чи має воно якесь відношення до появи пухлин?
Відповіді на перше питання були отримані лише після відкриття 3-CH3S-MAB і встановлення можливості реакції між N-бензоілоксі-МАБ і іншими амінокислотами, крім метіоніну. Маючи в своєму розпорядженні цією інформацією, Лін і Міллери змогли легко довести, що в розглянуту реакцію залучаються головним чином метіонін і тирозин. Є також відомості про участь в реакції цистеїну білка.
Чим сильніше канцероген, тим краще зв`язування білками
Питання ж про те, чи має зв`язування якийсь стосунок до появи пухлин, зуміли вирішити досить швидко. ДАБ, АБ і З`-метил-ДАБ, наприклад, є речовинами, канцерогенність яких корелює з інтенсивністю їх зв`язування білками. Випробовувалися також інші С-монометільние похідні ДАБ- виявилося, що швидкості, з якими ДАБ і його 5С-монометільние похідні досягають максимального рівня зв`язування (близько чотирьох тижнів для ДАБ), чудово збігаються з канцерогенною активністю цих сполук.
Гіпотеза про те, що зв`язування білками печінки служить причинним фактором у розвитку експериментальних гепатит, знаходить підтвердження не тільки завдяки згаданим вище результатами, але і на підставі наступних фактів:
а) якщо до їжі щурів разом з ДАБ додавати рибофлавін, то спостерігається не тільки зменшення числа виникають гепатит, ні і зв`язування барвників белкамі-
б) щури чутливі до ДАБ, а миші - немає. У цих двох видів виявлено та різний рівень зв`язування ДАБ білками печінки-
в) одночасне згодовування 3-метилхолантрен і ДАБ також призводить до придушення індукції гепатит і зв`язування барвника білками.
Всі ці дані свідчать про те, що утворення пухлин печінки залежить від того, зв`язується азокраситель (зокрема, ДАБ) білками печінки чи ні.
Канцерогенні ароматичні аміни зв`язуються переважно h2 -белкамі
У печінці міститься велика кількість різноманітних білків. Клітка печінки повинна не тільки підтримувати свою життєдіяльність, але і вирішувати цілу серію «суспільних проблем»: запасати глікоген для постачання всього організму глюкозою в разі необхідності, вжити через ворітну вену продукти харчування, розкласти їх і потім знову зібрати. Вона відповідальна також за частину тепла, що виробляється організмом. Для виконання перерахованих завдань необхідні ферменти, а все ферменти - це білки: звідси найширший спектр різних білків печінки.
Ефективним методом поділу компонентів білкової суміші є електрофорез. Білки розрізняються за своїм електричномузаряду - одні мають більший негативний заряд, інші більший позитивний. Відомі також білки з сумарним нульовим зарядом. Якщо білковий розчин помістити в електричне поле, позитивно заряджені білки перемістяться до негативного полюса, а негативно заряджені - до позитивного.
Такий поділ може бути, зокрема, вироблено на колонці (зональний електрофорез, фіг. 7). Білки, що підлягають розподілу, поміщають на колонку, заповнену підданої спеціальній хімічній обробці целюлозою, і через колонку пропускають електричний струм. Зазвичай нижня частина колонки служить позитивним полюсом, тому білки тим швидше опускаються вниз по колонці, чим більше їх негативний заряд. Через деякий проміжок часу напруга знімають, але за цей час окремі білкові фракції встигають розділитися по зонам. Потім колонку промивають (елюіруют), а вміст різних зон збирають в окремі пробірки.
На фіг. 8 показана так звана діаграма елюції (вимивання) після електрофорезу білків нормальної печінки. По осі ординат відкладені значення оптичної щільності елюата при 280 нм (міра концентрації білка) кожної фракції. Легко помітити, що поділ пройшло не повністю: видно перехлест фракцій. Характерним піках була присвоєна алфавітна, а недостатньо розділеним, що зливається піках - додаткова цифрова класифікація.
Електрофореграма була знята з білків печінки щурів, яким з їжею згодовували канцерогенний азокраситель З`-метил-ДАБ (Зороф). На фіг. 8 показані результати цього експерімента- на графіку відкладена не тільки оптична щільність при 280 нм (концентрація білка), але і оптична щільність при 525 нм елюата після додавання мурашиної кислоти (концентрація барвника). червоним
АНАЛІТИЧНІ МЕТОДИ: ЗОНАЛЬНИЙ ЕЛЕКТРОФОРЕЗ
Фіг. 7.
Білкові ПРОФІЛІ: Н -БЕЛКІ
показана оптична щільність при 525 нм. Барвник виявляється переважно у фракціях 130-140, відповідних так званим h2 -белкам.
У гепатома h2 -белков значно менше
Аналогічним способом були проаналізовані білки пухлин печінки. Як виявилося, у всіх досліджених гепатома (не тільки в гепатома, викликаних азобарвниками) hi -белкі містяться в значно меншій концентрації, ніж в здорової печінки. Не є винятком і повільно зростаючі гепатоми Морріса, які мало відрізняються від нормальної печінки.
Все сказане вище дозволяє підсумувати дані щодо зв`язування канцерогенних барвників білками печінки:
а) виявлена тісна залежність між канцерогенну активність і зв`язуванням белкамі-
б) барвники зв`язуються переважно певним класом білків - так званими h2 -белкамі-
в) зміст h 2 -белков і відповідно інтенсивність зв`язування барвника сильно знижені в гепатома.
Ці дані легко пояснити, виходячи з простих припущень:
- Якщо hi -белкі - регулятори росту, то слід очікувати, що їх зміст в гепатома повинен бути знижений.
- Всі речовини, які можуть специфічно реагувати з цими білками, повинні бути канцерогенами.
Незабаром після того як Міллери відкрили зв`язування азобарвників білками печінки і відсутність такого зв`язування білками гепатоми, вони сформулювали теорію, нині відому як «гіпотеза зникнення білка». Відповідно до цієї теорії, пухлинні клітини відрізняються від нормальних тим, що в них відсутні речовини, що регулюють нормальний ріст. Отже, злоякісне перетворення клітини печінки можна, мабуть, пояснити зникненням / i-білків. З такого висновку безпосередньо виходить наступна передумова для експерименту: якщо h-білки і справді регулятори росту, то можливо придушити зростання деяких клітин, виготовивши препарати з цих білків.
h2 -Белкі пригнічують ріст клітинних культур (in vitro)
Вперше цю спробу зробив Зороф. Використовуючи клітини Чи не La (клітини пухлини людини) і L-клітини (отримані з фібробластів миші), він додавав до їх культурам збагачені h2-білками фракції. Зростання клітин дійсно пригнічувався. Більш того, придушення було оборотним: як тільки / i-білки відмивали, клітини починали рости з колишньою швидкістю. Остання обставина виключало тривіальне допущення про те, що Л-білки просто токсичні і вбивають клітинні культури.
Експеримент Зорофа знаменував собою досягнення апогею в історії з h2-білками. Судячи з усього, h2-білки відіграють вирішальну роль у перетворенні нормальної клітини в пухлинну. Але слідом за тим з`явилися заперечення: h2-білки повинні пригнічувати ріст тільки клітин печінки, адже регулятор росту печінки повинен бути для них специфічний. Однак ні Чи не La, ні L-клітини не відносяться до клітин печінки. Вчені запідозрили, що виявлене Зорофом придушення викликається якийсь простіший причиною. І дійсно, пізніше було виявлено, що інгібуючий дію h2-білків викликано наявністю в них аргінази. Цей фермент розщеплює необхідний для росту клітин аргінін, що знаходиться в живильному середовищі, і в результаті клітини голодують. Додавання аргініну компенсувало інгібуючий дію / z-білків.
Цим справа не обмежилася: особлива роль h2-білків піддалася сумніву, так як з`ясувалося, що в ядрі клітини канцерогенні барвники зв`язуються головним чином альбуміноподобнимі білками. Більш того - і це завдало воістину тягчайший удар гіпотезі зв`язування білками, - виявилося, що канцерогенні аміни реагують і з нуклеїновими кислотами (Маррокен і Фарбер, Робертс і Уорвік). Тут ми стикаємося з проблемою: які ж реакції стратегічно важливі - реакції зв`язування білками, РНК або ДНК? Безперечно, левова частка зв`язування відбувається за рахунок / z-білків. Мабуть, їх високу специфічність можна пояснити, не вдаючись до надто хитромудрим прийомам, лише так: / z-білки і активують ферменти повинні бути ідентічнимі- активовані, реакційно здатні похідні азобарвників повинні вступати у взаємодію зі своїми найближчими партнерами, тобто саме з цими ферментами. Однак до сих пір ця гіпотеза не знайшла підтвердження (Зороф, Кеттерер). Нам залишається лише констатувати, що зараз ми не маємо скільки-небудь задовільними поясненнями можливої функції h2-білка.
Зв`язування канцерогенів ДНК навряд чи грає яку-небудь роль в кількісному відношенні, але воно відмінно «вписується» в теоретичні схеми сучасної біології. Чудова здатність пухлинних клітин «постійно породжувати пухлинні клітини» навіть під час відсутності зовнішнього канцерогену легко пояснюється: будь-яка зміна генетичного матеріалу (ДНК) неминуче передається дочірнім клітинам. Тим самим пухлинні клітини повинні генетично відрізнятися від нормальних клітин: такий, здавалося б, очевидний висновок. Але, по суті, це всього лише зручний висновок. Подальші зауваження і свіжіші відомості по ДНК і раку наведені в окремому розділі, спеціально присвяченій цьому питанню (стор. 238).
висновок
Канцерогенні ароматичні аміни (N, N-диметил-4-аміноазобензол і інші аміноазокрасітелі, бета-нафтиламин, бензидин, 2-ацетіламінофлуорен), активуються до ефективних форм за допомогою гідроксилювання. Ця реакція може протікати як по ароматичного кільця, так і по аминогруппе. Реакція N-гідроксилювання, мабуть, грає найважливішу роль: N-оксіаміни (аміди) в більшості випадків більш сильні і більш багатосторонні канцерогени, ніж вихідні аміни- Міллери назвали їх «безпосереднім канцерогеном». Продукти етерифікації N-оксіамідов взаємодіють in vitro з компонентами клітини, такими, як метіонін. І в самій клітині ефіри сульфатів можуть бути активною формою канцерогенних ароматичних амідів. У тих випадках, коли аміни виявляються більш канцерогенними, ніж відповідні аміди, або в разі, коли у тварин аміди не виявлені, «остаточним канцерогеном», мабуть, виявляється N-оксіамін.
Канцерогенні ароматичні аміни пов`язані переважно особливим класом розчинних білків (h -белкі). Канцерогенність і зв`язування білками добре корелюють один з одним, а зміст h -белков виявляється різко зниженим в гепатома. Згідно «гіпотезі зникнення», h-білки володіють регуляторним впливом на зростання. Втрата клітиною h-білків повинна бути безпосередньою причиною неконтрольованого зростання пухлин. І дійсно, обробка клітинних культур препаратами h-білка веде до оборотного пригнічення росту. Однак забруднює препарати фермент аргіназа виявився активним компонентом, оскільки він руйнує аргінін, необхідний для росту клітин.
Канцерогенні ароматичні аміни взаємодіють не тільки з білком, а й з нуклеїновими кислотами. Зв`язування канцерогену ДНК сьогодні розглядають як вирішальний фактор канцерогенезу.
