Трансформація in vitro - рак: експерименти і гіпотези

Як правило, пухлинні віруси можуть не тільки «проїдати» дірки в шарі відповідних клітин, але і порушити строгий порядок в культурі тканини.
Багато клітини, вирощувані в культурі тканини, підкоряються загальним порядком: вони діляться тільки до тих пір, поки є місце. Якщо утворюється товстий шар клітин, поділу припиняються: тісні контакти між клітинами запобігають нові мітози (феномен «контактного гальмування»).
Клітини, інфіковані пухлинними вірусами, іноді відмовляються підкорятися цим правилам: вони продовжують рости, навіть «наповзаючи» на сусідів і утворюючи нерівномірні шари. Такі морфологічні ознаки вже самі по собі в якійсь мірі нагадують невеликі пухлини. Більш того, по суті доведено, що проблеми, що накопичуються один на одного клітини є ні чим іншим, як справжні пухлинні клітини. Якщо їх імплантувати невластивому реципієнту (тварині того ж инбредной штаму, від якого спочатку були взяті клітини для даної культури), то у тварини утворюються справжні пухлини.
Іншими словами, «безладно зростаючі клітини» під впливом пухлинного вірусу перетворюються в пухлинні клітини (фіг. 40).
Ознаки трансформованої клітини

1.  Посилений темп зростання.
2.  Можливість необмеженого пассірованія в культурі тканини ( «постійна лінія»).
3.  Втрата контактного гальмування ( «нагромадження клітин» і «безладний зростання»).
4.  Освіта вирусспецифических антигенів.
5.  Освіта пухлин з імунологічної сумісністю.

Трансформація і загибель клітини

Трансформація і загибель клітин можуть супроводжувати один одного: якщо клітини ембріона миші інфікувати вірусом поліоми, то, крім просвітлінь в клітинному шарі, можна спостерігати і характерні безладні нагромадження клітин.
Але загибель клітин і трансформація - процеси настільки різні, що напрошується припущення про наявність двох різних типів вірусів. В такому випадку віруси, виділені з ділянок окремих просвітлінь, здавалося б, повинні були викликати тільки просвітлення, але не трансформацію.
Однак досвід показав зворотне: трансформація і руйнування клітин супроводжували один одного навіть у тих випадках, коли віріони були виділені з одного просвітлення. Отже, один і той же вірус може викликати як продуктивну інфекцію, так і трансформацію.

Клітини можуть робити вибір між продукуванням вірусу і трансформацією

Рішення про те, чи прийме клітина участь в продукуванні вірусів з подальшим своїм розпадом або піддасться трансформації і стане пухлинної, в значній мірі залежить від клітини-мішені. Відомі лінії клітин, які переважно лизируются вірусом SV- 40, і такі, які переважно піддаються трансформації (див. Фіг. 40).
Відіграють роль не тільки спадкові властивості клітини, але і її фізіологічний стан. Вірусної трансформації набагато легше піддаються зростаючі, діляться клітини, ніж клітини покояться (так звані стаціонарні клітини). Вірусна ДНК, ймовірно, легше вбудовується в ДНК клітини в процесі її реплікації. Це означає, що важлива не тільки лінія клітин, але і фаза клітинного циклу.
Зрозуміло, клітини не цілком вільні у «ухваленні рішення»: якщо обробити клітини надмірною кількістю SV-40, який зазвичай викликає лише трансформацію (множинна інфекція), то може статися «заборонене» продукування вірусу.
В одній клітці може бути вироблено кілька тисяч вірусних частинок, а трансформовані клітини, навпаки, як би зовсім не містять вірусу.

«Масковані» віруси

Власне кажучи, в тому, що трансформовані клітини більше не містять вірусу, немає нічого дивного. Цей факт узгоджується з колишніми даними про те, що в пухлинах, індукованих вірусами, вірус часто не вдається спостерігати. (Так, швидко зростаюча папілома Шоупа у домашніх кроликів більш не містить вірусу Шоупа.)
Тут можливі два пояснення:

1.  Віруси дійсно викликають трансформацію, але сформувалася пухлинної клітці вони більше не потрібні. Отже, віруси можуть не тільки ховатися, а й справді зникати.
2.  Але, як з`ясувалося, хоча віруси і можуть, очевидно, ховатися, вони все ж не втрачаються: вони впроваджуються в клітину і живуть в ній в «замаскованій» формі.

Класичною моделлю таких «маскованих» вірусів є бактеріофаги. Фаги - це віруси, які розмножуються в бактеріях і лизируют клітини бактерій. Однак розмноження і лізис настають не завжди. Іноді спостерігається так звана «безмовна інфекція» 1, при якій фаг проникає в клітину, але не руйнує її. Потомство таких інфікованих бактеріальних клітин здається здоровим, проте вони можуть раптово почати бурхливе продукування фагових частинок і руйнуються.
* У вітчизняній медичній літературі прийнято термін «дрімаючі інфекція». - Прим. ред.
Різні чинники визначають такий відстрочений вибух: ультрафіолетове опромінення, рентгенівське опромінення, перекису, різні барвники і канцерогени.
В латентно-інфікованих бактеріальних клітинах вірус не виявляється, однак після лізису він раптово знову з`являється в достатку. У таких клітинах він як би впадав в сплячку, але тим не менш брав участь у всіх клітинних діленнях і, таким чином, поводився подібно гену.
«Союз» бактерії і фага можна уподібнити «шлюбу», який в один прекрасний момент розпадається під впливом зовнішніх впливів: вірусний геном «приймає управління» і починає займатися виключно розмноженням фага. Господар поставляє все складальні конвеєрні лінії і енергію на службу фагу і врешті-решт гине.
ДНК пухлинних вірусів віддалено нагадує такі латентні фаги. Вірус поліоми і SV-40 також не зникають повністю з трансформованих клітин. Навіть в видно вільних від вірусу пухлинних клітинах є «свіжі сліди», які свідчать про присутність вірусу.

Слідами «маскованих» вірусів: вірусснеціфіческіе антигени

Перші сліди вдалося виявити завдяки імунологічних методів: в клітинах, трансформованих вірусом, містяться антигени, відсутні в нормальних клітинах. Вони різняться в залежності від вірусу, що викликав трансформацію. Так були виявлені антигени, специфічні по відношенню до вірусу поліоми або до SV-40
Вірусснеціфіческіе антигени були відкриті в ядрі трансформованих клітин і названі Т-антигенами (пухлинними антигенами). У хом`яків з пухлинами, індукованими вірусом поліоми, виробляються антитіла проти специфічних по відношенню до поліоми ядерних антигенів. Якщо їх помітити флуоресцирующим барвником, то антигени можна буде спостерігати під мікроскопом: клітини з Т-антигеном після інкубації з міченими антитілами характеризуються яскравим флуоресцирующим ядром, тоді як клітини без антигенів залишаються темними.
Т-антиген не є компонентом вірусу, таким, як, наприклад, білок його оболонки. Функції його досі не з`ясовані. Недавні дослідження показали, що клітини пухлин, індукованих вірусами, не завжди містять Т-антигени. Отже, вони не обов`язкові для трансформації.
Вірусспеціфіческой антигени можуть також локалізуватися на клітинній мембрані трансформованих клітин (антигени реакції відторгнення при трансплантації - АРОТ). Вони відповідальні за відторгнення пересаджених вірусних пухлин. Як ми бачили в попередньому розділі, можливе вироблення, правда обмеженого, імунітету проти пересаджених вірусних пухлин. Якщо спробувати вдруге ввести ту ж вірусну пухлина резистентності тварини, то клітини пересаджують пухлини не щепитимуться (за умови, - що вводиться не дуже багато клітин).
Локалізація таких трансплантаційних антигенів на клітинній мембрані добре вивчена.

1.  Загальноприйнято, що Трансплантаційні антигени розташовуються на поверхні клітини. Лише в цьому випадку можлива пряма реакція між пересадженими клітинами і клітинами імунної захисту.
2.  Імунні реакції можуть бути викликані не тільки інтактними трансформованими клітинами, але і їх «тінями». «Тінями» клітин називають їх оболонки з досить хорошою сохранностио поверхневих структур, одержувані при набуханні клітин і їх розриві в гипотоническом сольовому розчині.

Антигенні речовини самих вірусних частинок (білкові субодиниці) не ідентичні АРОТ-антигенів. АРОТ-антигени виробляються трансформованої клітиною відповідно до вказівок, що виходять від вірусного генома. Різні типи клітин виробляють одні й ті ж антигени при трансформації одним і тим же вірусом (див. Стор. 167).
Крім поверхневих антигенів, які виявляються при трансплантації, є також антигени, які вдається виявити безпосередньо in vitro (проба на агглютінацію- антитіла, мічені флуоресцеїном). Такі антигени часто називають S-антигенами.
Розглянемо тепер біологічне значення трансплантаційних антигенів. Трансплантація і відторгнення трансплантата є штучно створеною ситуацією, так би мовити, біологічно винятковим випадком, можливим лише в умовах експерименту. І все ж є достовірні свідчення про те, що вірус-специфічних речовини типу трансплантаційних антигенів відіграють певну роль і в «нормальному» розвитку вірусної пухлини.
Змінені антигенні структури пухлинної клітини попереджають систему імунного захисту господаря. Трансформовані клітини розглядаються як «нові», «чужі», і механізми захисту приводяться в дію. Під впливом вірусу частину власних клітин організму стає «чужий», що знаходить відображення в наступному:

1.  Клітини, що стали чужими, випадають з системи цілісного організму: переставши підкорятися правилам «суспільства», вони стають пухлинними.
2.  Але саме через те, що клітини стали чужими, господар отримує можливість здобути їх як чужорідний матеріал.

Відповідно до цієї теорії, S-антигени знаходяться в центрі вірусного онкогенезу: чим більше клітини стають чужими завдяки цим антигенів, тим легше їм ухилятися від нормальних регуляторних сигналів. Однак це ж обставина послаблює їхні позиції по відношенню до системи імунного захисту організму. Взаємозв`язок очевидна, хоча і не має поки строгого експериментального підтвердження.
Вірусспеціфіческой антигени не є єдиними «відбитками пальців» пухлинних вірусів в трансформованих клітинах. Особливо видають присутність вірусу вірусспеціфіческой РНК.

Слідами «маскованих» пухлинних ДНК-вірусів: вірусспеціфіческой РНК

Трансформовані пухлинні клітини виробляють вірусспеціфіческой інформаційну РНК. Виявлення цієї РНК здійснюється шляхом так званої гібридизації ДНК з РНК. Тут слід зробити невеличкий екскурс в теорію, щоб зрозуміти суть цього методу.
Інформаційна РНК отримує генетичну інформацію від ДНК, і послідовність нуклеотидів в ній визначається нуклеотидної послідовністю ДНК.

МОЛЕКУЛЯРНИЙ ПРИНЦИП гібридизації

ТЕХНІКА гібридизації
Отже, інформаційна РНК і ДНК комплементарні один до одного. Правда, окрема молекула інформаційної РНК являє собою «зліпок» лише з короткого відрізка нуклеотидной ланцюжка ДНК. Якщо ДНК і інформаційну РНК від однієї і тієї ж клітини змішати один з одним, то відповідні нуклеотидні ланцюжки двох нуклеїнових кислот знову об`єднаються попарно. Такі ДНК - РНК-комплекси можуть бути розділені і кількісно охарактеризовані. Якщо ж ДНК змішати з інформаційної РНК з різних джерел, то, як правило, буде спостерігатися лише слабка асоціація (фіг. 41).
Точно так же інформація, укладена в вірусної ДНК, перш за все переписується на молекулу РНК, і ця вірусспеціфіческой інформаційна РНК також може бути гібридизувати з вірусною ДНК. Отже, вірусспеціфіческой інформаційна РНК - це РНК, гібридизувати з вірусною ДНК.

У дослідах по гібридизації вірусної ДНК з РНК з незаражених нормальних клітин спаровування не спостерігається. І навпаки, якщо виділити РНК з трансформованих клітин і гібридизувати її з вірусною ДНК, то станеться часткова гібридизація між РНК і ДНК. І хоча спаровування підлягає лише дуже невелика частина загальної РНК трансформованої клітини, її зв`язування з вірусною ДНК визначається з високим ступенем надійності (фіг. 42). Це означає, що вірус-специфічних РНК присутній навіть в трансформованих клітинах, хоча самі віріони в них і не виявляються.
Отримані нові відомості є прямою вказівкою на присутність вірусної ДНК, інакше звідки б клітці взяти інформацію для синтезу цієї РНК?

Вірусна ДНК зберігається в трансформованих клітинах

Про наявність в трансформованих клітинах вірусної ДНК свідчить не тільки виявлення вирусспецифической інформаційної РНК вірусна ДНК була виявлена і прямими методами.
Докази знову грунтуються на методі з`єднання комплементарних ДНК і РНК. Для цього перш за все необхідно отримати вірусну інформаційну РНК, яка використовується як індикатор вірусної ДНК. Цю РНК можна виділити з суміші інформаційних РНК клітини і вірусу, екстрагованих з інформаційних клітин.
Вестфаль вибрав більш витончений шлях: він синтезував інформаційну РНК SV-40. З цією метою він використовував фермент, Полімеризується рибонуклеотиди до полинуклеотидов (РНК) в точній відповідності з так званої «затравочной» ДНК (ДНК-залежна РНК-полімераза). Послідовність нуклеотидів в такий синтетичної РНК виявляється комплементарної послідовності нуклеотидів, використовуваної затравочной ДНК. Якщо ж в якості «затравки» взяти вірусну ДНК, то можна отримати вірусснеціфіческую РНК.
Така синтетична вірусна інформаційна РНК може бути пов`язана з ДНК клітини, трансформованої пухлинними вірусамі- з ДНК нормальних клітин зв`язування не відбувається. З цього випливає, що вірусна ДНК постійно присутня в трансформованому клітці. Таким чином, «маскуватися» вірус не що інше, як «гола вірусна ДНК», або «ядро» вірусної частинки. За попередніми підрахунками є 10-50 вірусних копій на клітину. Всі копії локалізуються в ядрі клітини. Якщо згадати про те, що трансформація відбувається успішніше в ті фази клітинного циклу, коли здійснюється синтез
ДНК, то легко погодитися з припущенням про те, що вірусна ДНК вбудовується в ДНК клітини-господаря. При кожному діленні клітини вірусна ДНК ділиться разом з усією ДНК клітини. В іншому випадку вона повинна була б поступово зникнути і її не можна було б виявити.
У повному розумінні слова метод гібридизації нуклеїнових кислот доводить лише те, що принаймні частина вірусної ДНК зберігається в трансформованому клітці. Нові методи дозволяють зробити ширші узагальнення: доведено, що в трансформованому клітці зберігається весь геном вірусу SV-40.

Демаскування пухлинного вірусу: злиття клітин викликає продукування вірусу

В останні роки вдалося добитися злиття клітин ссавців (Ефруссі, Харріс). При цьому утворюються клітини, що мають спочатку два або більше ядра- через деякий час формується одне ядро, яке містить хромосоми обох батьківських клітин.
У природі таке злиття клітин вищих організмів є рідкістю. Його можливо спостерігати лише в особливих випадках, коли «суперклетка», що виникла в результаті злиття, має в порівнянні зі звичайними батьківськими клітинами перевага у відборі. Однак такого злиття можна домогтися штучним шляхом, обробивши клітини вірусом Сендай. Цей вірус, названий на честь міста в Японії і зазвичай викликає захворювання типу грипу, здатний викликати також злиття клітин в культурах: мабуть, він містить «фактор злиття», який специфічно впливає на клітинні стінки. Злиття клітин може бути викликано і «мертвим» (інактивованих ультрафіолетовим опроміненням) вірусом Сендай. В останньому випадку усувається необхідність в «зупинці» продукування вірусу після злиття клітин.
Використовуючи описаний метод, Копровскі зумів здійснити злиття цілої серії трансформованих клітин (очевидно, без вірусу) з нормальними клітинами, в яких можливо продукування вірусу. Продукування вірусу починалося в освічених таким чином багатоядерних гібридах клітин. Нормальна «продуктивна» клітина перетворює «маскувати» вірус трансформованої клітини в продуктивний вірус (див. Фіг. 40).
В ході проведених експериментів з`ясувалося, що:
1) в трансформованих клітинах може зберігатися весь геном вірусу, оскільки злиття клітин викликає утворення повних вірусних частинок-
2) по-видимому, в трансформованому клітці не відбувається якихось реакцій, необхідних для продукування повних вірусних частинок. У трансформованому клітці немає синтезу білкової оболонки і відповідно масового виробництва вірусної ДНК. Тому, як можна вважати, трансформована клітина (принаймні в цьому відношенні) тримає вірус під контролем.