Чи існує «контактне гальмування»? - рак: експерименти і гіпотези
Відео: Новини науки від 13.10.2016 (лікувальний котофей)
Фактори зростання проти нього
До сих пір ми допускали, що контактне гальмування виникає як наслідок контакту між клітинами: клітини ростуть доти, поки контакти зі всіх сторін не починають стримувати їх подальше зростання.
Як вважають, в організмі поділ клітин знаходиться під контролем завдяки наявності інгібіторів, що виробляються тканиною (ми називали їх «Халонен»). Якщо перенести це уявлення на культури клітин, це означатиме, що слід шукати інгібітори, що виробляються спочивають клітинами і здатні специфічно блокувати поділ клітин.
До теперішнього моменту пошуки, мабуть, не приносили успіху. Клітини можна культивувати на мембранних фільтрах. Якщо верхня поверхню диска фільтра повністю обростає клітинами, то для нових клітин залишається можливість рости на нижній поверхні. Отже, клітини, що розростаються по верхній поверхні фільтра, не виробляють інгібіторів.
Судячи з усього, регуляторний механізм интактной тканини не грає ролі в регулюванні ділення клітин в культурі. Однак це не означає, що контактне гальмування відбувається головним чином при контакті клітин. Холлі знайшов просте рішення цієї проблеми, вивчаючи ріст клітин ЗТЗ (постійний штам фібробластів миші).
Клітини ЗТЗ демонструють особливо яскравий випадок контактного гальмування. У нормальних умовах культивування вони виростають до суцільного моношару, а після досягнення цієї стадії негайно припиняють зростання. При цьому щільність клітин досягає 106 на одну чашку Петрі (діаметром 6 см).
Однак дослідники давно помітили - і не тільки для клітин ЗТЗ, - що при додаванні середовища, що містить свіжу сироватку теляти, в культурі клітин із зупиненим було зростанням відзначається нова хвиля митозов. Ця обставина змушує припустити, що фактори росту в сироватці теляти переважають над контактним гальмуванням.
Фіг. 27.
Потім Холлі виявив, що щільність клітин в культурі з контактним гальмуванням залежить від концентрації поживних речовин в середовищі. Клітини ЗТЗ ростуть до різної кінцевої концентрації в залежності від вмісту сироватки в середовищі (фіг. 27).
Але при посадці 6 -106 клітин на чашку Петрі культура завершує своє зростання незалежно від концентрації сироватки. Це не знайшло свого відображення на кривих зростання. Отже, за остаточну концентрацію клітин в культурі клітин ЗТЗ, очевидно, відповідальні один або кілька факторів росту, що містяться в сироватці теляти. У міру вичерпання цих факторів зростання припиняється.
В результаті виявляється, що клітини ЗТЗ не ростуть в «виснаженої» середовищі (див. Рис. 27): якщо взяти середу стаціонарної культури і додати її до інших клітин ЗТЗ, ділення клітин не відбудеться. Нові ділення можливі лише при додаванні свіжої сироватки теляти.
Пухлинні клітини поводяться зовсім інакше: клітини ЗТЗ, трансформовані вірусом SV-40, ростуть навіть в «виснаженої» середовищі. Це означає, що їхні потреби в факторі зростання значно нижчі. Подібні спостереження були зроблені на культурі фібробластів курчати (Тьомін): нормальні фібробласти відчували потребу у свіжій сироватці, між тим як фібробласти, трансформовані вірусом саркоми Рауса, обходилися набагато меншими її кількостями.
Отже, найважливіше відмінність між нормальною і пухлинної клітинами в культурах тканин полягає в різних потребах в факторі зростання. Чи мають при цьому місце контакти, не настільки істотно.
Але, мабуть, ще рано замінювати в наших уявних побудовах «контактне гальмування» «факторами зростання». Навіть розглядаються спільно з мембранним контролем фактори росту, мабуть, не дають повного уявлення про те, що відбувається насправді.
Інгібітори гарантують контактне гальмування
Повернемося знову ненадовго до клітин ЗТЗ, на яких особливо наочно можна продемонструвати контактне гальмування. Що станеться, якщо вирощувати ці клітини в культурі з постійно оновлюваною середовищем (так звана перфузионная культура)?
Якщо лише чинники зростання визначають максимально досяжну щільність клітин, то клітини ЗТЗ, вирощувані в подібних умовах, повинні наростати один на одному, утворюючи в результаті багатошарові культури. Саме цього і не відбувається. Кастор провів кінозйомку перфузионной культури ЗТЗ і виявив, що ці клітини все одно зростають у вигляді моношарів. Вдавшись до цейтрафферной (сповільненій) зйомці, Кастор зауважив те, що Холлі вдалося побачити до нього, а саме що ці клітини стискаються після первинного контакту, але все ж зупиняють своє зростання. Отже, навіть в таких умовах кінцеве число клітин в культурі обмежено.
Що ж тоді обмежує зростання клітини, якщо клітинні контакти і фактори росту не визначають всієї картини? Не виключено, що контакт між клітинами в досить щільному шарі обумовлює виробництво інгібітора, який і зупиняє поділ клітин. Йе і Фішер поставили експеримент, підпору уявлення інших вчених про те, що такі фактори дійсно існують в «старій» середовищі (тобто середовищі від культури з контактним гальмуванням). Оновлюючи середу в культурі із зупиненим ростом, можна викликати додаткові мітози приблизно у 6% клітин. Як не дивно, вдалося також ініціювати подібні «заборонені» клітинні ділення ще одним способом: «стару» середу спочатку замінювали фізіологічним розчином, а розчин в свою чергу знову заміняли старої середовищем.
Цей на перший погляд дивний факт можна пояснити, якщо припустити наявність інгібітору: фізіологічний розчин відмиває інгібітор і клітини знову виявляються готовими до поділу. Перші етапи синтезу нової ДНК і наступні мітози починаються вже в фізіологічному розчині (на підставі даних по синтезу РНК, згідно Йе і Фішеру), але цей процес не знаходить свого завершення в фізіологічному розчині через нестачу поживних речовин. Останні поставляються «старої» середовищем, яка і замінює фізіологічний розчин. Звичайно, інгібітор все ще присутній в старому середовищі, але, оскільки процес, що веде до поділу, вже почався, він не впливає на що почався мітоз. (Інгібітор має низький молекулярна вага і відмивається шляхом діалізу старої середовища.)
Наведені дані суперечать результатам описаного вище експерименту з мілліпоровие фільтром, де було показано, що клітини, що утворюють моношар на верхній поверхні фільтра, не виділяють інгібіторів росту. Однак це протиріччя легко усунути: інгібітор Йе і Фішера зовсім не повинен пригнічувати зростаючі клітини. Його призначення-підтримувати контактне гальмування. Тому не слід дивуватися, що він не пригнічує клітини, які не перебувають в контакті. (Правда, деякі клітини, такі, як фібробласти WI -38 людини, вивчені Гарсією-Жіраттом, мабуть, все ж продукують речовини, що пригнічують і зростаючі клітини.)
Аналіз розглянутих досліджень безпосередньо підводить нас до концепції Халонен, про яку ми говорили на стор. 103. Халонен також є інгібіторами, які впливають на клітини, які знаходяться в контакті в тканини (опускаючи сумнівні Халонен лейкозу). Як зазначалося вище, концентрація Халонен залежить від маси тканини. У клітинних культурах, очевидно, діють подібні механізми: після досягнення певної граничної щільності клітин концентрація інгібітора виявляється достатньою, щоб зупинити поділ клітин у всій популяції.
Таким чином, регуляція росту в культурі тканини, який би штучної вона не здавалася на перший погляд, виявляє очевидну схожість з регуляцією зростання в интактном органі. Але цього слід було очікувати, так як поведінка клітин в культурі тканини дозволяє судити про їх поведінку і в організмі тварини: пухлинні клітини, які не дотримуються запропонованому порядку in vivo, не підкоряються і правилам «контактного гальмування» в культурі клітин.
Розглянемо ще раз чинники, що визначають максимальну щільність популяції в культурі тканини, навіть якщо намальована нами картина і виявляється неповною:
а) наявність факторів зростання самих по собі не викликає сомненій-
б) одних інгібіторів недостатньо-
в) більш того, очевидно, недостатньо і самих клітинних контактів.
І все ж ясно, що такі контакти, так само як і клітинні мембрани, грають важливу роль у вирішенні питання про те, чи будуть клітини взаємно пригнічувати один одного. Безумовно, існує щось важливіше, ніж відмінності у властивостях поверхонь мембран пухлинних і нормальних клітин, більш суттєве, ніж прості відмінності, про які ми тут говорили (зв`язування кальцію, зміст нейрамінової кислоти і т. Д.). Нещодавно вдалося виявити відмінності між мембранами пухлинної і нормальної клітини, які, можливо, мають безпосереднє відношення до фактору росту. Іншими словами, було встановлено причину, через яку пухлинні клітини ростуть без контактного гальмування, в той час як нормальні клітини підкоряються «порядку».
