Багатоступенева гіпотеза хімічного канцерогенезу - рак: експерименти і гіпотези
З часу перших досліджень Ямагіва на вусі кролика шкіра не раз ставала об`єктом вивчення штучно викликаного канцерогенезу. Причини цього очевидні: за шкірою легко спостерігати, з нею легко працювати, а для нанесення будь-якого канцерогенного речовини досить простий піпетки. Не менш важливо і те обставина, що розвиток пухлин можна спостерігати візуально. Немає необхідності в пальпації або аутопсіі- уважного спостереження досить, щоб встановити, виникли пухлини на спинці миші або на вусі кролика (і якщо так, то скільки).
Експеримент Беренблюма - Моттрама: два етапи в розвитку папілом
Для індукування пухлин шкіри зазвичай досить нанести 0,1 мл 0,3% -ного розчину метил холантрена, бензопірену або діметілбензантрацена (ДМБА) в ацетоні на поголені спинки мишей по одному або кілька разів на тиждень. Можна навіть викликати папіломи і карциноми однієї великою дозою, хоча відсоток утворення пухлин при цьому буде досить низьким. Крім «класичних» методів, існують і більш тонкі способи утворення пухлин шкіри:
- Мишам наносять на шкіру або згодовують канцерогенний вуглеводень (25 мкг на спинку або 1 мг при годуванні) в дозі, недостатньою для індукування пухлин протягом нормального життєвого циклу піддослідних тварин.
- Після цього мишам щотижня наносять на спинку 0,5% -ний розчин кротонового масла (масло насіння тропічної рослини Croton tiglium). Приблизно через вісім тижнів починають візуально виявлятися перші папіломи. Якщо кротоновое масло наносять без попередньої обробки тваринного канцерогеном, то пухлини не виникають. Отже, кротоновое масло в цих умовах не є канцерогеном.
Експеримент вперше був здійснений Моттрамом, а пізніше вдосконалений і в великих масштабах поставлений Беренблюмом. Було показано, що комбінація двох неканцерогенних компонентів може призвести до виникнення пухлин:
Субпорогових одинична доза канцерогену +
+ Неканцерогенними кротоновое масло ------------------------------------- Пухлина.
Напрошується порівняння з процесом фотографування: як відомо, після екстенсивної експозиції світло викликає зображення на світлочутливої платівці. Однак зазвичай платівку експонують лише протягом дуже короткого проміжку часу ( «субпорогових доза»), щоб викликати появу прихованого зображення, а потім відбувається хімічне прояв активованих зерен солі срібла до видимих зерен металевого * срібла. Отже, в принципі субпорогових освітлення в поєднанні з хімічним проявом призводить до того ж кінцевого результату, що і екстенсивна експозиція сама по собі.
Все сказане дозволяє інтерпретувати експеримент Беренблюма - Моттрама наступним чином: ДМБА або якийсь інший канцерогенний вуглеводень індукує виникнення прихованих пухлинних клітин, які потім виявляються і під впливом кротонового масла утворюють пухлину. Виникнення прихованих пухлинних клітин зазвичай називають ініціацією, а індукування справжньої великої пухлини - промоціей1. Ініціацію можна уподібнити субпорогових висвітлення фотопластинки, в той час як активація (ефект кротонового масла) відповідає її хімічному прояву.
Якщо ми спочатку виявимо фотопластинку і лише потім піддамо її впливу світла, зображення, зрозуміло, не буде. Беренблюм поставив аналогічний експеримент з Кротоновий маслом і канцерогенним вуглеводнем і виявив, що обидва компонента при впливі в зворотній послідовності не ведуть до утворення пухлин.
* Термін «промоція», що означає «підбурювання», дуже вдало відображає процес, але не прийнятий у вітчизняній науковій літературі. Радянські вчені (Р. Е. Кавецький) цю фазу канцерогенезу називають «активацією». - Прим. ред.
Активатором може бути не тільки кротоновое масло
Хоча кротоновое масло і привело до відкриття активації латентних пухлинних клітин, воно зовсім не є єдиним речовиною, здатним до цього. Таку ж дію можуть надавати миючий засіб «Твін», антралін (1,8,9-3-оксіантрацен) і різні феноли. «Повні канцерогени», мабуть, можуть і ініціювати, і активувати (наприклад, канцерогенні вуглеводні), але при одноразової меншій дозі їх ефект обмежується ініціацією.
Наведена гіпотеза дозволяє передбачити існування речовин, здатних тільки ініціювати, але не активувати, - їх можна розглядати як додавання до Кротоновий маслу. Така речовина було відкрито: ним виявився уретан (етілкарбамат), який є чистим ініціатором для шкіри миші. У мишей, спинки яких обробили уретаном і протягом декількох тижнів змащували Кротоновий маслом, відмічено утворення папілом. Один же уретан, навіть при тривалому нанесенні, не викликає розвитку пухлин шкіри. Отже, можна індукувати пухлини комбінацією двох явно неканцерогенних речовин.
Роздратування і канцерогенез
А тепер простежимо, яким чином Беренблюм дійшов до цієї гіпотези. Він почав зовсім не з кількісних відповідностей латентних періодів і «виходу» опухолей- його просто зацікавило питання: чи має роздратування, як таке, якийсь стосунок до канцерогенезу?
Більшість канцерогенів належить до числа речовин, які в досить великих дозах викликають роздратування тканини, так що це не був просте запитання. Багато вчених не сумнівалися, що між роздратуванням тканини і появою пухлини є явна залежність. Роздратування шкіри проявляється гіперплазією (див. Фіг. 52): зростання числа клітинних поділів покликаний компенсувати втрату пошкоджених клітин. Таким чином, питання, поставлене Беренблюмом, можна сформулювати так: чи має гіперплазія якийсь стосунок до канцерогенезу? Ось що пише з цього приводу сам дослідник:
«Спочатку ми перевірили на канцерогенність різні прості подразники. Всі вони викликали гіперплазію шкіри мишей, але не утворення пухлин. Очевидно, роздратування саме по собі не здатне до канцерогенному ефекту.
Потім ми застосували різні неканцерогенними подразники спільно з канцерогеном, щоб з`ясувати, чи не посилюється чи від додаткового подразнення канцерогенний ефект. Результати виявилися такими, що бентежать. Одні подразники, особливо гірчичний газ (іприт - отруйна речовина, використана під час першої світової війни) і кантаридин, при нанесенні в сильно розведених розчинах, здатних лише викликати дуже слабке шкірне роздратування, різко послаблювали канцерогенний ефект (тобто проявляли антиканцерогенну дію), в той час як інші подразники, особливо кротоновое масло, різко посилювали канцерогенний ефект (тобто надавали коканцерогеннимі дію). Більша ж частина подразників взагалі не чинила ніякого впливу. Тому здавалося, що роздратування не є вирішальним фактором в канцерогенезі навіть в тому випадку, якщо"є інші, більш дієві фактори ».
Проте Беренблюм вирішив зробити ще одну спробу:
«На наступному етапі, проводячи загальний курс обробки піддослідних тварин канцерогеном, ми замінили канцероген неканцерогенними подразником лише на короткий період ... У ролі подразника використовували кротоновое масло. Як виявилося, при нанесенні цієї речовини протягом декількох місяців перед обробкою канцерогеном ні прискореного розвитку пухлин, ні підвищення «виходу» пухлин не спостерігалося, тоді як при нанесенні після неповного курсу канцерогенної обробки «вихід» пухлин різко підвищився ».
Цей експеримент безпосередньо передував (по протоколу) експерименту Моттрама, який в якості останнього логічного ланки в розвитку експериментальних систем дозволив зробити наступний висновок: виникнення раку шкіри - процес двоступінчастий. Пухлини легкого також можуть бути індуковані в ході процедури, яка, принаймні технічно, складається з двох етапів. Однак, перш ніж впритул перейти до розгляду цієї експериментальної процедури, повернемося ще раз до питання, який з самого початку поставив Беренблюм: чи має роздратування якийсь стосунок до канцерогенезу, або (в особливому випадку експерименту з раком шкіри) має гіперплазія якесь або відношення до виникнення пухлин?
Але це питання слід сформулювати точніше: ми повинні розрізняти, чи має гіперплазія щось спільне з ініціацією або активацією. Досліди з уретаном дали по
Принаймні один ясну відповідь: гіперплазія аж ніяк не є необхідною для формування прихованих пухлинних клітин. Після згодовування тваринам уретану не спостерігалося ні ушкодження епідермісу, ні відповідних репаративних процесів.
Що ж стосується активації, то тут отримані не настільки чіткі результати. Тому роботи Геккера з співробітниками набули особливої важливості: дослідникам вдалося ізолювати і виявити структуру кількох активних компонентів кротонового масла. При використанні одного з цих компонентів (названих Геккера ТПА) виявилося можливим провести експерименти по двохетапному канцерогенезу на чіткій кількісній основі. З`ясувалося, що ТПА не тільки активатор, а й сильний запальний (2 мкг ТПА, нанесених на спинку миші, викликають велику відшарування епідермісу і набряк шкіри), а також гиперпластический фактор.
З використанням форболових ефірів у вирішенні даної проблеми з`явилися нові можливості: докладне знання молекулярної структури цих речовин дозволяє виробляти в їх молекулах цілком конкретні перебудови і таким чином з`ясувати, які компоненти складної молекули визначають її біологічну активність. У такого роду експериментах можна виявити сполуки, які володіють або тільки запальним, або тільки активує дію. З іншого боку, «чисті» агенти з «чисто» коканцерогеннимі дією досі також не були відомі.
Раус виявляє двоступеневий процес в дослідах на вухах кролика
На той час (1941), коли Беренблюм опублікував дані своїх перших експериментів про застосування кротонового масла на шкірі миші, Раус повідомив про досліди, проведені на вухах кролика, які дозволили йому зробити ті ж висновки. Його спостереження зводилися до наступного:
- При обробці вух кролика кам`яновугільної смолою розвиваються пухлини. Якщо обробку перервати, то в багатьох випадках пухлини зникають. Якщо ж знову почати обробку смолою, то пухлини виникають в тих же місцях.
- Повторна обробка смолою була єдиним фактором, який будив «дрімає» пухлина: цьому сприяла також обробка скипидаром або хлороформом, які самі по собі не є канцерогенами. Пухлина виникала і в процесі загоєння рани. Проткнув штопором дірку в вусі тварини, Раус викликав розвиток пухлини в рані.
І знову був зроблений висновок, що утворення пухлини сприяють принаймні два процеси:
а) індукування «дрімаючих» пухлинних клітин
б) розмноження цих «дрімаючих» клітин і формування з них пухлини в результаті неканцерогенними процесу.
Кротоновое масло не можна вважати «хімічним штопором»
Зроблене Раусом спостереження про те, що просте загоєння рани після механічного пошкодження істотно прискорює ріст пухлини, здавалося б, повинно було наштовхнути вчених на думку розглядати кротоновое масло в якості своєрідного «хімічного штопора». Іншими словами, кротоновое масло слід вважати причиною утворення рани, загоєння якої є не що інше, як коканцерогеннимі процес. Однак такої концепції суперечать дані про те, що багато речовин, що викликають запалення і сприяють розвитку регенеративної гіперплазії ( «загоєння рани»), не є коканцерогеннимі.
Морфологічне вивчення шкіри, обробленої ТПА, також вказує на специфічний ефект: перш за все не відбувається утворення рани, а отже, руйнування клітин епідермісу. Спочатку набухають базальні клітини, в тому числі і їх ядра, а потім відбувається інтенсивне розмноження клітин (гіперплазія). Багаторазові ділення клітин не спрямовані на загоєння рани- клітини продовжують ділитися навіть при відсутності рани. Справжня рана утворюється пізніше, коли відривається цілий шар шкіри.
Для відтворення повної картини недостатньо двох стадій
Баутвеллу вдалося ще повніше розділити фазу активація - розвиток прихованих пухлинних клітин. З цією метою мишей спочатку обробляли ДМБА, а потім Кротоновий маслом і скипидаром. Деталі експерименту наведені на діаграмі (фіг. 12).
Отже, скипидар може відтворювати деякі ефекти кротонового масла, але пізні, а не ранні. Іншими словами, він, мабуть, здатний довести активацію до кінця, хоча починати її не може. Для першої стадії активації Баутвелл запропонував термін «конверсія». Тим самим він підкреслював, що на цій стадії потенційні пухлинні клітини перетворюються в справжні «дрімаючі» пухлинні клітини, які пізніше, розмножуючись, дадуть пухлина. Судячи з усього, специфічна гіперплазія або загоєння рани дають поштовх до розмноження клітин, але не до їх перетворення.
Активація оборотна
Зовсім не байдуже, через які інтервали часу обробляти миша Кротоновий маслом. Якщо сумарну дозу (1,5 мг) давати вкрай малими одиничними дозами і часто або ж звичайні ефективні дози давати з дуже великими перервами, то, згідно з Баутвеллу, в обох випадках буде спостерігатися виражене зниження відсотка утворення пухлин.
Це означає, що ефект кротонового масла звернемо на відміну від результатів аналогічного експерименту з ДМБА, суммация дії якого (ми про це говорили раніше) була правилом.
ініціація необоротна
Тривалість відрізка часу з моменту ініціації до початку обробки Кротоновий маслом не настільки істотна. Латентний період і вихід пухлин залишаються тими ж - як у випадку проведення активації відразу, так і через 40 тижнів. Це означає, що ініційовані клітини зберігаються і, якщо можна так сказати, «чекають сигналу» від кротонового масла. Подібна стабільність воістину разюча, бо за 40 тижнів популяція епідермальних клітин часто повністю змінюється і генерація клітин, оброблених канцерогеном, вже давно змінилася новими клітинами. Отже, видозмінена генетична інформація потенційних пухлинних клітин повинна бути неодноразово переписана.
Однак такий висновок зовсім не є обов`язковим, оскільки змінені клітини можуть перебувати в тканини і бути виключеними з процесу постійної клітинної регенерації. Правда, така альтернатива є дещо штучною, більш вірогідною здається все-таки гіпотеза, яка припускає процес повної зміни епідермальних клітин. На фіг. 13 представлені дві моделі, що відрізняються один від одного просторової орієнтацією мітозу. Модель Б дозволяє легко пояснити, чому число пухлинних центрів протягом тривалого відрізка часу залишається постійним і чому навіть після року зберігається постійна цифра виходу пухлин. Правда, у цій моделі один недолік: можливо, вона абсолютно невірна.
РОЗПОДІЛУ клітин в епідерміс МИШІ
Фіг. 13.
Модель А здається більш ймовірною, оскільки «вислизають» клітини, показані на схемі, дійсно спостерігаються під мікроскопом (Іверсен). За повідомленням Буллоу, в епідермісі миші мітози орієнтуються, як правило, таким чином, що обидві дочірні клітини залишаються в базальному шарі: «Ймовірно, тільки завдяки зростаючому тиску клітини видавлюються в зовнішні шари, де починається синтез кератину». Авторадіографіческімі дослідження також підтверджують модель А. Іверсен позначив епідермальні клітини, що знаходяться в S- фазі, тимідин, міченим по тритію, і простежив за зміщенням мітки. Як виявилося, лише 10% мічених клітин відразу мігрують у верхні шари, переважна ж частина їх після мітозу залишається в базальному шарі. Керуючий підтвердив спостереження Іверсена методом авторадиографии.
Модель А дозволяє також пояснити, чому число прихованих пухлинних клітин (в середньому) не змінюється з часом. Однак цілком можливо, що випадкові приховані пухлинні клітини «видавлюються» відповідно до вищезазначеного механізмом на поверхню і губляться, але більша частина прихованих пухлинних клітин з теорії ймовірностей залишається в базальному шарі. Іншими словами, чим довше період до початку обробки Кротоновий маслом, тим більших коливань у виході пухлин можна ожідать- це означає, що число тварин-пухлиноносіїв повинен знижуватися. І дійсно, так сталося в одному випадку з чотирьох відомих авторам.
Універсальність двоступеневої гіпотези ставиться під сумнів
Досліди на вусі кролика і шкірі миші відносяться до числа найбільш важливих, але не єдиних прикладів двоступеневих експериментів. Хаггінс виконав наступний чудовий досвід: одній групі щурів штаму, у якого ніколи не спостерігалися спонтанні саркоми, підшкірно ввели сезамову масло (часто використовуваний носій для жиророзчинних сполук). Інша група отримувала метилхолантрен (MX) з їжею. Ні в однієї з груп піддослідних тварин пухлини не розвивалися. Але якщо щурам, яким згодовували MX, ін`єктували до того ж сезамову масло, то в місці ін`єкції у них розвивалися саркоми. Напрошується висновок, що вводиться з їжею канцероген перетворює деякі клітини сполучної тканини в приховані пухлинні клітини, які потім активуються в результаті роздратування, викликаного ін`єкціями масла.
Незважаючи на все сказане, індукування пухлин відповідно до двоступеневої схемою навряд чи знайде загальне експериментальне застосування. Якщо ще розвиток лейкозів і може слідувати цій схемі, то для індукування гепатит задовільних двоступеневих систем поки не знайдено. Навіть шкіру мишей можна розглядати просто як шкіру: так, шкіра хвоста стійка по відношенню до тривалої обробці ДМБА, а шкіра вух не дає пухлин при змазуванні ТПА, якщо одночасно згодовувати тварині ДМБА. У щурів стандартні двоступеневі процедури, спрямовані на індукування пухлин, дали негативні результати.
Якщо ж ДМБА або діетілнітрозамін (Дена) ін`єктувати в субпорогових дозах хомячкам, а потім дати їм вдихати порошок окису заліза (гематит), то розвивається рак бронха. До таких же результатів приводить використовування на другому етапі в якості активного агента «неканцерогенними» двоокису сірки.
Сінканцерогенез: канцерогени можуть взаємно заміняти один одного
З відкриттям великого числа різних хімічних канцерогенів перед дослідниками постало питання: запускає чи в рух всі ці речовини якийсь єдиний механізм, що веде до розвитку пухлин. Канцерогени можна знайти серед різних класів хімічних сполук, таких, як поліциклічні ароматичні вуглеводні, ароматичні аміни і нітрозаміни. Уретан є мінімальною комбінацію аміду і ефіру, а тіосечовина - це сечовина з атомом сірки замість атома кисню.
Така множинність фізико-хімічних властивостей дозволяє припустити, що індукування, зокрема, гепатит за допомогою введення ДАБ або Дена відбувається двома абсолютно різними шляхами. Однак подібне припущення повністю спростовується експериментом. При одночасному згодовуванні обох канцерогенів досить 60% мінімальної дози кожного з`єднання, щоб викликати пухлину (Джміль). Отже, Дена значною мірою здатний заміняти ДАБ.
І це далеко не поодинокий випадок. У 30-0-х роках Хайджер і Раш вже показували взаємозамінність 3,4-бензпірен і ДМБА, а Фрідріх-Фрекс (1940) виявив, що метилхолантрен може замінювати бензпірен і навпаки. Цілком припустимо, що близькоспоріднені речовини, такі, як вуглеводні, можуть бути взаємозамінними в цьому плані. Однак навіть зовсім різні речовини (4-нітрохінолін-N-оксид і 3-метилхолантрен), за свідченням Накахари, можуть заміняти один одного в індукуванні раку шкіри.
Особливий інтерес викликали успішні спроби індукувати рак шкіри одночасно обробкою хімічними канцерогенами і опроміненням. Хошино з співавторами вводив в субпорогових дозах 4-нітрохінолін-Н-оксид і одночасно піддавав (3-опроміненню 90Sr- при цьому у тварин розвивалися папіломи, фібросаркоми і карциноми. На підставі отриманих даних автори прийшли до висновку, що 4-нітрохінолін-1Ч- оксид і (3 -опромінення мають якісно еквівалентним дією.
Джміль на підставі своїх дослідів прийшов до наступного висновку: «Суммация канцерогенних ефектів наводить на думку, що місце атаки канцерогенного фактора
в клітці має бути строго фіксірованним- в іншому випадку суммацию не можна було б пояснити ».
(Під час експерименту Хошино є одна суттєва деталь: небайдуже, коли вводиться 4-нітрохінолін-1Ч-оксид- до або після опромінення.)
Не виключено, що взаємозамінність канцерогенів можлива не на всіх етапах канцерогенезу. Відповідно до гіпотези Беренблюма і Рауса, це має означати, що у різних канцерогенів первинні ефекти повністю розрізняються, але при цьому канцерогени володіють однією загальною властивістю - здатністю до активації.
Сінканцерогенез і коканцерогенез: питання не тільки термінологічний
Концепція сінканцерогенеза (Бауер) і концепція коканцерогенеза синонімічні лише на перший погляд. Під сінкацерогенезом розуміють сінергіческое дію канцерогенів, в той час як під коканцерогенезом увазі чинники, які сприяють канцерогенезу, але самі по собі не є канцерогенними. Так, кротоновое масло - коканцерогеннимі речовина, яка сама по собі неканцерогенними.
У строгому сенсі слова кротоновое масло канцерогенно: при великих дозах можна отримати досить високий відсоток освіти папілом. Кротоновое масло являє собою суміш багатьох речовин, і не виключено, що активують і канцерогенні властивості належать різним його компонентів. Саме з цієї причини Геккер Фракціоновані кротоновое масло, прагнучи виділити і дати характеристику властивостей чистих з`єднань. Але навіть він не зумів відповісти на початковий питання, оскільки чистий активатор в великих дозах все ж проявив слабку канцерогенність.
У результаті був зроблений наступний висновок: двоступеневі експерименти по суті представляють собою лише особливий випадок сінканцерогенеза- ми ж спостерігаємо взаємодію різних канцерогенів, що відрізняються тільки характером дії - підсилює або суммирующим. Якщо дотримуватися такої точки зору, то між ініціацією і активацією не існує особливих відмінностей. Це, однак, знаходиться в повному протиріччі з фактами, викладеними вище, а вони свідчать про те, що
ініціація на відміну від активації необоротна. Крім того, як вже зазначалося раніше, виникнення пухлини залежить від послідовності впливу ряду факторів. Наприклад, обробка Кротоновий маслом до нанесення канцерогену ефекту не дає. І останнє: несправжній канцерогенний ефект кротонового масла і його чистих компонентів легко пояснити - в експерименті важко виключити спонтанну ініціацію пухлин в результаті впливу таких факторів, як ультрафіолетове опромінення або космічні промені. Кротоновое масло лише проявляє спонтанно індуковані приховані пухлинні клітини.
висновок
Хімічне індукування папілом на прикладі шкіри миші можна розділити на дві фази (стадії, ступені). У першій (ініціація) індукуються так звані приховані пухлинні клітини-у другій (активація) ці клітини, розмножуючись, дають пухлина.
Активація може проходити під впливом неканцерогенних речовин-до найвідомішим з них відноситься кротоновое масло. Ініціація на відміну від активації необоротна.
Однак двоступенева гіпотеза укладається не в усі експериментальні схеми.
