Бактеріофаг - мікробіологія з технікою мікробіологічних досліджень
Бактеріофаги представляють собою віруси бактерій, які проходять через мелкопорнстие фільтри і розмножуються за рахунок живих молодих бактерій. Бактеріофагія- це процес взаємодії бактеріофага і бактерій і в точному перекладі означає «пожирання бактерій». Останнім часом виділені фаги і до променистим грибів - актиноміцетів. Бактеріофаги широко поширені в природі. Вони зустрічаються всюди, де є відповідні для їх існування мікроби: воді, ґрунті, молоці, на фруктах і овочах, в організмі здорових людей і тварин і т. Д. Виділяються вони з випорожнень при дизентерії, черевному тифі, холері, з гною і мокротиння при інших інфекціях.
Перші спостереження над явищем бактеріофагії належать найбільшому радянському мікробіологові Н. Ф. Гамалія, який ще в 1898 р показав, що густа суспензія сибіркових паличок в дистильованої воді може просвітлюватися і купувати здатність розчиняти бактерії.
Д&rsquo-Ерелль (1917) вперше піддав систематичного вивчення явище бактеріофагії. вперше д&rsquo-Ереллем фаг був знайдений в випорожненнях людей, видужуючих від дизентерії. Крапля фільтрату з випорожнень хворої людини, внесена в пробірку з культурою дизентерійних паличок, викликала поступове розчинення бактерій. При цьому д&rsquo-Ерелль встановив наступний основний факт: здатність викликати просвітлення дизентерійних культур, пов`язана з розчиненням наявних в них бактерій, не тільки не виснажується при цьому розчиненні, а, навпаки, зростає. Крапля просвітленої рідини, перенесена в свіжу суспензія дизентерійних паличок, знову лизирует їх. Для настання феномена д&rsquo-Ерелля дві умови є обов`язковими: активний початок - бактеріофаг і живі розмножуються бактерії.
Кожен вид фага характеризується певною величиною частинок. Розмір фагів коливається в межах від 20 до 200 ммк, т. Е. Дорівнює розміру вірусів. Під електронним мікроскопом фаг представляється овальним освітою з відростком, нагадуючи форму сперматозоїда (рис. 44). Головка фага складається з білкової оболонки і наповнена зернистим вмістом (дезоксірібонукленновая кислота). Хвостова частина являє собою циліндричний футляр і серцевину, нагадуючи голку шприца. Відросток фага в 1,5 рази довше головки і в 4 рази тонше (рис. 45). Зустрічаються круглі і паличкоподібні фаги. До складу бактеріофагів входять: білки, ДНК або РНК, вуглеводи і ліпіди.
Мал. 44. Морфологія бактеріофага.
Мал. 45. Схема будови бактеріофага.
Вражаючи мікробну клітину, фаг прикріплюється до її поверхні джгутиками, розташованими па кінці відростка. Потім в оболонці бактерій, в ділянці прикріплення фага, утворюється отвір, через який всередину клітини проникає дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) фага. Розрив бактерійної оболонки обумовлений наявністю в фаге литического ферменту, розташованого в хвостовій частині оболонки фага. Бактеріальна клітина під впливом внедрившегося фага зазнає структурні і біохімічні зміни. При цьому в ній відбувається розмноження і накопичення нових частинок фага. Мікробна клітина набухає, збільшується в розмірах, потім оболонка її руйнується і фаги звільняються. Вивільнені фагів частинки знову вражають бактеріальні клітини. Кількість фагів в одній клітці може досягати 200-1000.
За характером взаємодії з бактеріальною клітиною розрізняють вірулентні і помірні фаги. Вірулентні фаги вражають чутливі до них мікроби, розмножуються в них і виділяються в середу при лизисе клітини. Помірні фаги також інфікують чутливі клітини, але викликають лізис тільки однієї частини бактерій з утворенням вегетативного фага, більшість клітин набуває імунітет (несприйнятливість) до наступному зараженню цим фагом. У таких клітинах фаги не розмножуються, залишаються в симбиотическом стані і не викликають лізис бактерій-їх називають профаг. Бактерії, що несуть такі профаг, називаються Лізогенія, а симбіоз клітини з профагом - Лізогенія. Лізогенія бактерії широко зустрічаються в природі. Звільнення фага з лізогенной культури може бути викликано іонізуючоїрадіацією, перекисом водню та іншими факторами зовнішнього середовища. Тоді лізогенна культура стає нелізогенной і здатна продукувати вірулентні фаги.
Фаги мають яскраво виражену специфічністю, т. Е. Вони розчиняють певні види або типи бактерій. Розрізняють монофаги, лизирующие мікробів одного виду, полифаги - активні щодо кількох споріднених видів і типів і фаги, здатні лизировать тільки певні штами одного виду бактерій. У той же час фаги мають здатність адаптуватися до інших видів бактерій.
У порівнянні з більшістю одноклітинних організмів фаг стійкий до зовнішніх впливів. Пряме сонячне і розсіяне світло знищує його активність в 2-3 дні-під впливом ультрафіолетових променів фаг гине через 10 хвилин. Більшість фагів витримує нагрівання до 70 °. До хімічних і дезинфікуючим речовин бактеріофаг більш витривалий, ніж бактерії. Наприклад, ефір, хлороформ, спирт, толуол тимол, крезол, ацетон, 0,5% розчин сулеми, 1% розчин фенолу майже не діють на фаг. Бактеріофаг має велику чутливість до кислот і перед його прийомом всередину необхідно випити слабкий розчин соди для нейтралізації кислого вмісту шлунка.
Активність фага по відношенню до відповідних мікробам може змінюватися.
Фаги, як зазначено було вище, є вірусами-паразитами бактерій і актиноміцетів. Про живій природі фага свідчать його структура, механізм дії на бактерії, розмноження, здатність до адаптації і успадковується мінливість.
Для виявлення фага досліджуваний рідкий матеріал (вода, молоко) центрифугують. Екскременти та інші матеріали полужидкой і щільною консистенції перед центрифугуванням розводять фізіологічним розчином. Отриману надосадову рідину в кількості 1 мл переносять у флакон з 30 мл м`ясо-пептонного бульйону, попередньо засіяного 1 мл молодий (6-18 годинний) культурою мікроорганізму, відповідного шуканого фагу. Посів ставлять в термостат при 37 ° на 24 години. Потім посів фільтрують через фільтр Зейтца, фільтрат розводять стерильним фізіологічним розчином 1: 10, 1: 100 і 1: 1000. З кожного розведення по 1 мл переносять в пробірки і додають 0,05 мл відповідної культури бактерій. Контролем служить пробірка з 1 мл бульйону, що містить бульонную культуру мікроорганізму без фільтрату. Всі пробірки ставлять в термостат. Через 18-20 годин враховують результат. Просвітлення живильного середовища свідчить про наявність фага, в контрольній пробірці відзначається нормальний ріст культури.
Виявлення фага на щільному живильному середовищі. Чашки Гейденрейха-Петрі заливають 1,5% м`ясо-пептони агаром, агар остигає, а потім його поверхню засівають по можливості рівномірно 16-18 годинний бульонной культурою бактерій, гомологічних шуканого фагу. Посів повинен бути суцільним по всій поверхні агару. Через 5-10 хвилин на підсушену поверхню поживного агару наносять краплями випробовувані фільтрати в різні сектори чашки. Після того як рідина вбереться в середу, чашки перевертають догори дном і ставлять в термостат при 37 ° на 24 години. При наявності бактеріофага на місці нанесення краплі може бути відсутнім зростання бактерій, або з`являються колонії з поїдені краями або центром, або безліч цілком відмежованих стерильних ділянок - стерильних плям (рис. 46).
Мал. 46. Явище бактеріофагії.
Кількісний вміст фагів виявляється титруванням.
Титрування бактеріофага в рідкому поживному середовищі за методом Аппельман а. При титруванні в 10 пробірок однакового діаметра наливають по 4,5 мл бульйону. В першу пробірку вносять 0,5 мл випробуваного фага. Потім роблять послідовні розведення, переносячи окремими піпетками з пробірки в пробірку по 0,5 мл розведеного фага. З останньої 0,5 мл суміші виливають і в усі пробірки додають по одній краплі 18-часовоп бульонной культури 11-я і 12-я пробірки є контрольними. У першій з них знаходиться бульйон і культура (без фага), у другій-м`ясо-пептонпий бульйон (контроль на стерильність). Всі пробірки поміщають в термостат при 37 ° на 18 годин. Остання пробірка, що містить прозору середу, визначає титр фага. Титр фага - то найбільше розведення, в якому спостерігається повний лізис, і умовно позначається у вигляді від`ємної ступеня розведення. Якщо остання пробірка, в якій бульйон залишається прозорим, 8-а, то титр даного фага дорівнює 10-8.
Титрування бактеріофага і а щільного поживного середовища за методом агарових шарів Грац і а. Цей метод полягає в наступному. Чашки Гейденрейха-Петрі заливають 1,5% мясопептонний агаром в кількості 25-30 мл. Для придушення зростання повітряної мікрофлори до агару додають 0,004% спиртовий розчин генціанвіолета (0,1 мл фарби на кожні 100 мл агару). Агар закривають стерильною фільтрувальним папером і ретельно його висушують під бактерицидною лампою протягом декількох годин або в термостаті 30 хвилин. Чашки закривають кришкою і залишають до наступного дня при кімнатній температурі. Потім готують різні розведення фага, як і при титруванні за методом Аппельмана. У пробірки, містять по 2,5 мл розплавленого і охолодженого до 44-46 ° 0,7% агару, вносять 1 мл розведення титруемого фага і 0,1 мл відомої, чутливої до цього фагу культури бактерій. Вміст пробірок перемішують, обертаючи їх між долонями, і виливають другим шаром в чашки з 1,5% агаром. Після рівномірного розподілу суміші чашки залишають на 30 хвилин при кімнатній температурі, а потім їх поміщають в термостат при 37 °. Після 18 годин перебування в термостаті підраховують кількість негативних колоній (стерильних плям) на 2-3 чашках з найбільш високим розведенням фага. З цих даних виводять середнє арифметичне число колоній і отриману величину множать на ступінь максимального розведення. наприклад:
Розведення фага 10-6 82 колонії,
»» 10-7 51 колонія,
»» 10 ~ 8 26 колоній.
Середнє число колоній бактеріофага 53 (159: 3). Титр досліджуваного бактеріофага дорівнює: 53Х10-8.
Практичне значення фага різноманітно. Його застосовують як з терапевтичної, так і з профілактичною метою (при дизентерії, холери та ін.). У хірургічній практиці застосовують стафілококовий, стрептококовий, протейний і синьогнійної бактеріофаги, а також бактеріофаг проти збудників анаеробної інфекції, який використовують місцево для зрошення ран, вологих пов`язок, тампонади.
Найактивніше діють полівалентні препарати, що складаються з декількох фагів проти різних типів одного виду мікробів, а також смесп з різних фагів.
Фаг, як препарат, являє собою фільтрат бульонной культури бактерій, які зазнали фаголізису. Це абсолютно прозора, вільна від живих мікробів рідина, жовтувато-солом`яного кольору. Сухий фаг готують в таблетках з крохмалем або цукром. Рідкий фаг в прохолодному і сухому місці зберігає свою активність протягом 0,5-2 років, а сухий вже через 4-6 місяців зберігання значно втрачає свою силу.
У мікробіологічних лабораторіях фаги застосовують для цілей діагностики, причому феномен лізису може бути використаний в двох напрямках:
а) для визначення виділеної культури за допомогою фага, типова приналежність якого ізвестна-
б) для визначення виду виявленого бактеріофага за допомогою чутливої до нього культури бактерій.
Фаготіпірованіе бактеріальних культур (черевнотифозні, дизентерійні) має і епідеміологічне значення, дозволяючи встановити джерело і шляхи поширення інфекції.
Для прискореної діагностики ряду інфекційних захворювань (черевний тиф, дизентерія, чума та ін.) В мікробіологічну практику В. Д. Тімакова і Д. М. Гольдфарбом введена реакція наростання титру фага (РНФ). Сутність цієї реакції полягає в тому, що до досліджуваного матеріалу додають певну кількість індикаторного (специфічного) фага і ставлять в термостат. Якщо в досліджуваному матеріалі знаходяться бактерії, відповідні внесеного фагу, кількість корпускул фага збільшиться, в іншому випадку титр бактеріофага дорівнюватиме вихідного (техніка постановки РНФ описана в розділі «Лабораторна діагностика дизентерії» на стор. 261).
Виявлення бактеріофага в воді може служити показником забрудненості останньої відповідної мікрофлорою.
В останні роки фаг широко використовується як генетична модель для вивчення багатьох общебиологических проблем сучасної генетики.
