Дихання мікробів - мікробіологія з технікою мікробіологічних досліджень

Життя мікробів, як і всіх живих істот, пов`язана з безперервним витрачанням енергії, і, отже, для підтримки фізіологічного рівноваги необхідне постійне відновлення її запасів. Останнє здійснюється мікроорганізмами за допомогою процесу дихання.
На відміну від тварин і вищих рослин процес дихання у мікробів, незважаючи на їх мікроскопічну величину, відрізняється своєю складністю і різноманіттям, в основі якого лежить дія різних ферментів. За типом дихання мікроорганізми діляться на три групи:

1. облігатні аероби, що розвиваються тільки при вільному доступі кисню. Процес дихання у них здійснюється за участю молекулярного кисню повітря (наприклад, холерний вібріон).
2. облігатні анаероби, здатні жити тільки за відсутності кисню повітря (наприклад, правцева паличка).
3. факультативні анаероби, до яких відноситься величезна більшість патогенних мікроорганізмів-вони можуть існувати як під час відсутності кисню повітря, так і при незначному доступі його.

Роботами Пастера вперше було встановлено, що ряд мікроорганізмів може розвиватися в безкисневому середовищі, отримуючи необхідну енергію при розщепленні складних органічних речовин поживного субстрату. Процеси глибокого розщеплення безазотистих органічних сполук, в основі якого лежить зазвичай анаеробне дихання, називається бродінням. Процес аеробного і анаеробного дихання здійснюється біологічними каталізаторами (ферментами), які здатні при диханні активувати протягом окислювальних реакцій. При аеробному і анаеробному диханні в першій фазі процесу відзначається активація водню ферментами з групи дегідрогеназ, які віднімають водень від субстрату (живильного середовища) і переносять його від однієї органічної молекули до іншого-від одного акцептора до іншого (від лат. Acceptor- сприймає). А так як в структурі атома водню на орбіті є один електрон, то процес відібрання водню від субстрату є окислювальним. В останній фазі при аеробному диханні аеробні дегідрогенази передають відібраний від субстрату водень безпосередньо кисню повітря, який є кінцевим акцептором. При цьому може утворитися перекис водню, яка грає роль окислювача органічних сполук. Фермент каталаза, наявний у всіх аеробних організмів, розкладає перекис водню на воду і кисень, а фермент пероксидаза активує кисень перекису.
Анаеробні дегідрази не можуть віддавати водень кисню повітря, а передають його іншим акцепторам (ферментам, іншим речовинам, які з`являтимуться в процесі бродіння).
Як при аеробному, так і при анаеробному диханні спостерігається, окислення одних речовин і відновлення інших.
Сутність окислення полягає у втраті електронів окислюється речовиною, а при відновленні відбувається приєднання електронів відновлюються речовиною.
Таким чином, акти дихання у мікроорганізмів є ряд послідовних окисно-відновних процесів, які призводять до звільнення необхідної для їх життєдіяльності енергії.
Найбільш доступними продуктами для окислення аеробними мікробами є цукру, спирти і органічні кислоти. Складні азотисті сполуки використовуються для дихання в останню чергу. Анаеробні мікроби в якості окисляемого субстрату використовують органічні сполуки і мінеральні речовини.

Анаеробне дихання є менш економічним, ніж аеробне, що видно з наступного прикладу. У процесі аеробного розщеплення однієї молекули виноградного цукру звільняється 674 калорії тепла. (СбН120б + 602 = 6С02 + 6Н20 + 674 калорії), а при анаеробному розкладанні тієї ж молекули - лише 27 калорій (C6Hi206 = 2C2H50H + 2C02 + 27 калорій).
Примітка. Тип дихання мікроорганізмів знаходить своє відображення в характері їх зростання на штучних поживних середовищах. Так, наприклад, туберкульозна паличка, будучи облігатним аеробом, в пробірці або колбі з живильним бульйоном зростає тільки поверхнево, у вигляді плівки, залишаючи середу прозорою, анаеробні бацили - тільки придонні, а бактерії кишково-тифозної групи (факультативні анаероби) ростуть однаково в усіх шарах бульйону, даючи дифузний зростання.
Методи культивування анаеробів. Для культивування анаеробів, крім відповідних поживних середовищ, необхідно створити безкисневі умови середовища. Методів культивування анаеробних бактерій існує багато. За принципами, покладеним в основу цих методів, їх можна розділити на хімічні, фізичні та біологічні.
Хімічні методи. Є два методи вирощування анаеробів. Перший метод полягає в тому, що засіяні анаеробами пробірки або чашки поміщають в замкнутий простір (наприклад, ексикатор) і ставлять який-небудь поглинач кисню - гипосульфит натрію і лужної розчин пирогаллола. На 1 г пирогаллола беруть 10 мл 10% розчину NaOH- це кількість речовини здатне зв`язати кисень в обсязі близько 200 мл повітря.
Найпростіші способи здійснення анаеробіозу за допомогою цієї суміші такі:

1. Ватяну пробку пробірки з посівом даної культури підрізають, опускають кілька вглиб і змочують розчином (0,5- 1 мл). Доступ повітря припиняється шляхом закупорювання гумовою пробкою або гумовим ковпачком.

1. Метод Бухнера. Пробірку з культурою поміщають у спеціальну пробірку Бухнера (рис. 40) або в пробірку з перетяжкою (картопляну), куди попередньо всипають 1 г пирогаллола, потім доливають піпеткою по стінці 10 мл 10% розчину NaOH і щільно закривають пробірку гумовою пробкою.
2. Для культивування мікробів на середовищах в чашках Гейденрсйха - Петрі користуються спеціально сконструйованими Ексикатор. Чашки поміщають на металеву підставку або в скляний стакан. Пирогаллол насипають заздалегідь, лужний розчин доливають через воронку, тут же закривають кришку, заклеюють пластиліном або заливають парафіном.
   
   Мал. 40. Пробірки Бухнера для культивування анаеробів.
   За другим методом до живильних середовищ додають речовини, редуцирующие надходить в них кисень. До таких речовин відносяться пировиноградная кислота, цистеїн, глюкоза, глікокол і ін. У цьому випадку можливий розвиток анаеробів при доступі молекулярного кисню повітря.
   Фізичні способи.
   
   Мал. 41. анаеростатах.

1. Видалення повітря з живильних середовищ перед засівом кип`ятінням в водяній бані протягом 15 хвилин і подальшим швидким охолодженням до 45-50 °. Для того щоб не дати можливості повітрю знову проникнути в середу, пробірки запаюють, або поверхню середовища заливають стерильним парафіновим маслом.
2. Отримання ізольованих колоній в глибоких шарах середовища за способом Віньяль. Техніка посіву за методом Віньяль наступна: в 3-4 пробірки з розплавленої агарового середовищем роблять посів досліджуваного матеріалу з поступовим його розведенням. Чи не застиглий ще після засіву агар з кожної пробірки набирають в пастерівські піпетки, які потім запаюють тільки з відтягнутого кінця (при запайке щоб уникнути розбризкування матеріалу можна тримати протилежний кінець затиснутим). Трубки швидко охолоджують і переносять в термостат. Через 2-3 дні при вдалому розведенні вихідного матеріалу можна спостерігати окремі колонії.

Для виділення колонії у наміченого на трубці місця роблять надріз напилком, після чого трубка легко надломлюється. На цьому місці вміст виливають в стерильну чашку Гейденрейха - Петрі, колонію беруть петлею або втягують в тонку відтягнуту піпетку і переносять в бульйон або уколом в стовпчик цукрового агару.

1. Видалення повітря (а отже, і кисню) з середовища механічним шляхом. Для цього користуються особливими приладами - анаеростатах (рис. 41). Анаеростатах в простій формі являє собою прямокутну або циліндричну металеву коробку, закривається кришкою на гумовій прокладці. Циліндр забезпечений металевим краном, що приєднується до насоса. Пробірки та чашки з посівами поміщають всередину, повітря викачують насосом. Для культивування строгих анаеробів досить знизити тиск до 1 мм.

Біологічні методи. З біологічних методів найчастіше застосовується зараження тварин і метод Фортнера.
При зараженні тварин використовуваний матеріал вводять тварині в суміші зі специфічною сироваткою. Цей метод може бути використаний в двох напрямках:

1. Для виділення мікробів з суміші. Якщо мікроб відповідає сироватці, він гине. Інші ж мікроби, які не відповідають даній сироватці, виділяються з тварини.
2. Для визначення токсинів. При наявності в досліджуваному матеріалі токсину тварину, яка отримала його в суміші з антитоксической сироваткою, виживає. Контрольне тварина гине. Така постановка діагнозу широко застосовується при біологічної пробі на токсин.

Метод Фортнера. Цей метод наближає лабораторну техніку до природних умов розвитку анаеробних мікроорганізмів. Фортнера застосував метод симбіозу аеробних мікробів, здатних енергійно поглинати кисень повітря (Bact. Prodigiosum), з анаеробами, засіяних на кров`яний агар в чашці Гейденрейха - Петрі. Чашка розділена на дві частини вирізаної смужкою агару, щоб при суцільному зростанні уникнути змішування культур. На одну половину чашки засівають досліджуваний на анаероби матеріал, на іншу - свідомо відомий облігатних аероб (Bact. Prodigiosum Сас. Subtilis і ін.).
Для ізоляції внутрішнього простору чашки від зовнішньої атмосфери краю її заливають воском або заклеюють пластиліном. Методом Фортнера можна отримати хороший поверхневий зростання анаеробів.
Живильні середовища для вирощування анаеробів. Бульйон Китта - Тароцці. У пробірку з м`ясо-пептони бульйоном, додають шматочки звареної і промитої окропом на ситі печінки (3-5 г на пробірку) або м`ясний фарш, заливають вазеліновим маслом і стерилізують при 115 ° протягом 30 хвилин.
Кров`яний агар з глюкозою (Цейсслера). Слаболужній агар, що містить 2-3% агар-агар і 2% глюкози, розливають у великі пробірки (25 см довжини і 2,5 см в діаметрі), приблизно по 60 мл в кожну, стерилізують 30 хвилин при 110 ° і в такому вигляді зберігають. Перед вживанням агар розтоплюють на водяній бані, охолоджують до 45 °, в кожну пробірку додають 12-15 мл стерильної дефибринированной крові, перемішують і розливають в 3-4 чашки Гейденрейха-Петрі. Готові чашки витримують перед посівом 2 діб при кімнатній температурі.
Агар для трубок Вейона. До мартенівському бульйону додають 2% агару і 0,5% глюкози. Встановлюють pH 7,4, розливають у вузькі пробірки (діаметр 0,3-0,5 см, довжина 20 см). Стовпчик агару повинен бути не вище 2/3 довжини пробірки і стерилізують дрібно 3 дні по 40 хвилин в текучепаровом апараті.