Ферменти - мікробіологія з технікою мікробіологічних досліджень
Мікроорганізми, як і всякі клітини, здійснюють обмін речовин (живлення і дихання) за допомогою ферментов- біологічних каталізаторів. Без ферментів немає життя мікробної клітини. З придушенням активності ферментів пов`язаний перехід мікробів в анабіотичних стан, з активированием ферментів - розвиток життєдіяльності клітини, проростання спор, посилення інтенсивності росту і розмноження. За своїми властивостями і характером дії ферменти бактерій подібні
з ферментами, що утворюються в клітинах і тканинах рослин і тварин.
Біологічне значення гидролитических ферментів полягає в тому, що вони здійснюють процеси розщеплення високомолекулярних органічних сполук на більш прості, доступні для асиміляції. В результаті цих реакцій такі сполуки, як жири, розщеплюються на жирні кислоти і гліцерин, полісахаріди- на моносахариди, білки - в кінцевому підсумку на амінокислоти. Розпад білків викликають ферменти - протеази, вуглеводів - карбогідрази, жирів - естерази. Ферменти, що виділяються мікробами в зовнішнє середовище, називаються Екзоферменти. Завдяки їх дії складні сполуки розщеплюються на більш прості, доступні засвоєнню. Більшість ферментів є внутрішньоклітинними - Ендоферменти ам і. Вони обумовлюють пластичну діяльність мікроорганізмів і синтез складних сполук у клітині.
Так як процеси гідролітичного розпаду поживних субстратів відбуваються поза бактеріальної клітини, вся виділена при цьому енергія втрачається для неї. На противагу цьому ендоферменти активні всередині клітини, і енергія, що звільняється в ході цих реакцій, використовується бактерією для здійснення життєвих функцій.
Кількість ферментів у різних мікроорганізмів різному. Ферменти в своїй дії на різні речовини відрізняються суворої специфічністю. Наприклад, фермент мальтаза розщеплює тільки мальтозу, лактаза-тільки лактозу і т. Д. Вивчення ферментативної здатності мікробів відіграє велику роль при визначенні видів (ідентифікації) мікроорганізмів. Наприклад, для диференціації брюшнотифозной палички її від морфологічного «двійника» кишкової палички використовують здатність останньої зброджувати лактозу, так як відомо, що збудник черевного тифу цією здатністю не володіє.
Біохімічні властивості бактерій
Вивчення культуральних властивостей не може бути вирішальним при визначенні виду мікроба. При зростанні бактерій на живильних середовищах відбуваються різноманітні хімічні процеси, обумовлені ферменту
тивной діяльністю бактерій. Одні з ферментів розщеплюють білки і вуглеводи, інші викликають реакцію окислення і відновлення. Змінами, наступаючими в середовищі під дією ферментів, користуються для цілей діагностики.
Визначення протеолітичної здатності мікробів. Багато мікроби в процесі життя виділяють ферменти, що розщеплюють білки, так звані протеолітичніферменти. Способів визначення їх існує багато. Найбільш простим способом є посів уколом в стовпчик желатини. Розрідження її свідчить про наявність протеолітичного ферменту. Желатину розріджується стафілококами, холерним вібріоном, сібіреязвенной бацилою і деякими іншими мікроорганізмами. Протеолиз можна спостерігати при посіві на згорнуту кінську сироватку і в молоко. У першому випадку протеолиз виражається розрідженням і утворенням заглиблень на поверхні середовища, в другому спостерігається просвітлення молока або розчинення згортка казеїну. Процес розщеплення білка може доходити до освіти індолу, аміаку і сірководню.
Визначення індолу. 1. Спосіб Ерліха - Беме. Для визначення індолу за цим методом необхідно мати: розчин 1, що складається з 4 г парадіметіламідобензальдегіда, 380 мл 90 ° спирту, 80 мл соляної кислоти-розчин 2 насичений при нагріванні розчин персульфата калію (K2S2O2). Техніка визначення індолу наступна. До бульонной культурі додають 1-2 мл ефіру, грунтовно струшують і додають по стінці пробірки 1-2 мл розчину 1 і стільки ж розчину 2. У присутності індолу не пізніше ніж через 5 хвилин повинно з`явитися червоне забарвлення всього ефірного шару або нижній його частині ( рис. 39).
Червоне забарвлення в бульйоні при безбарвному ефірі не приймається в розрахунок.
- Спосіб Мореля. Фільтрувальну папір рясно змочують гарячим водним насиченим (12%) розчином щавлевої кислоти, висушують в термостаті і нарізають на смужки шириною 0,5 см. Смужку паперу поміщають в засіяну пробірку з бульйоном Хоттингера або пептонную воду (фіксують смужку одним кінцем під ватяною пробкою таким чином , щоб вона не
стосувалася середовища). Після цього пробірку ставлять у термостат. При утворенні індолу частина папірці забарвлюється в рожевий колір через 1-3 дні. Поява забарвлення слід спостерігати при світлі.
Визначення сірководню. Кінцевим продуктом розпаду білка є сірководень (H2S). Для його виявлення в культурі користуються смужкою фільтрувального паперу, змоченою оцтовокислим свинцем. Таку папірець поміщають під ватяну пробку в пробірку з засіяної випробуваної культурою на бульйоні. Якщо культура виробляє сірководень, то папірець буріє або чорніє від утворюється сірчистого свинцю (див. Рис. 39).
Визначення ферментації цукрів. Багато мікроби мають здатність розкладати вуглеводи з утворенням кислот і газів. Для того щоб виявити процеси розкладання тих чи інших цукрів, застосовують кольоровий ряд (середа Гіссен). У пробірку з середовищем опускають запаяну з одного кінця трубочку (поплавок) для виявлення газу. Можна також користуватися полужидкой середовищем Гисса без поплавка. Якщо мікроб в процесі життя розкладає той чи інший вуглевод з утворенням кислоти, то спостерігається зміна кольору середовища, причому поплавок залишається на дні. На присутність газу вказує розрив напіврідкого агару або освіту газу в поплавці (див. Рис. 24 на вклейці).
Мал. 24. Зростання брюшнотифозной палички на середовищах з вуглеводами.
1 - лактоза- 2 - глюкоза- 3 - мальтоза- 4 - манніт- 5 - сахароза.
1 - Ерліха (освіта індолу) - 2-на сірководень.
Визначення редуцирующей здатності. Редукує здатністю називається здатність мікробів знебарвлювати органічні фарби, перетворюючи їх в безбарвні лейкопродукти. Для визначення редуцирующей здатності вживають метиленовийсиній, метіонін, лакмус, індигокармін, нейтральрот і т. Д.
Дослідження редуцирующей здатності мікроорганізмів проводиться таким чином. До живильних середовищ - бульйону або агару - додають зазначені вище розчини фарб і проводять посів випробуваної культури. У процесі росту при наявності
у мікробів редуцирующей здатності спостерігається знебарвлення середовища.
Визначення каталази. Багато мікроби виробляють фермент каталазу. Каталаза розкладає перекис водню з утворенням води і неактивного кисню. Найбільш простим методом визначення каталази є наступний. На поверхню 24-годинної культури на скошеному агарі наливають 1 мл перекису водню і ставлять пробірку похило. Якщо виходять бульбашки газу, то це означає, що каталаза є і реакція вважається позитивною. Якщо бульбашки не утворюються, реакція вважається негативною.
