Холерний вібріон - мікробіологія з технікою мікробіологічних досліджень

Холерний вібріон (Vibrio cholerae asiaticae), відкритий Р. Кохом в 1883 р, є збудником гострого важкого інфекційного захворювання - холери, яка характеризується ураженням шлунково-кишкового тракту з явищами загальної інтоксикації і локалізацією збудника в тонкому кишечнику.

Мал. 81. Холерний вібріон.
1 - в чистій культуре- 2 - мазок з іспражненій- 3 - розрідження желатини.

Морфологія і тинкторіальних властивості. Холерного вібріона властивий виражений поліморфізм. В забарвлених препаратах він має форму зігнутої палички довжиною від 1,5 до 3 км і шириною від 0,2 до 0,4 мк. Ступінь зігнутості дуже різна: поряд зі слабо зігнутими формами у вигляді коми зустрічаються форми півкола. На штучних поживних середовищах і в організмі хворих людей вібріони можуть приймати форму прямих паличок, ниток, довгих спіралей, коків. Суперечка і капсул не утворює, дуже рухливий-монотріх (рис. 81), легко забарвлюється всіма аніліновими фарбами, грамотріцатель.
Культуральні та біохімічні властивості. Холерний вібріон невибагливий до живильних середовищ, добре і швидко розмножується на щільних і рідких середовищах лужної реакції (pH 7,6-82), строгий аероб, оптимум росту 37 °. На м`ясо-пептонном лужному агарі через
10-12 годин інкубації в термостаті утворюються круглі, дрібні (1-2 мм в діаметрі) колонії з гладкою поверхнею, стекловіднопрозрачние в прохідному світлі. Консистенція колоній масляниста, при малому збільшенні мікроскопа вони гомогенні, світло-жовтого кольору. У більш пізні терміни (після 18 годин стояння в термостаті) вони мутніють. На бактоагар TCBS (див. Стор. 287) колонії холерного вібріона великі, жовті, щільні на тлі блакитно-зеленого кольору середовища. При стоянні з жовтих стають зеленими. На середовищі Аронсона колонії яскраво-червоного кольору з блідо-рожевою або безбарвної облямівкою, а на середовищі Монсурі через 24 години росту утворюються прозорі або напівпрозорі колонії сірувато-чорного кольору з помутнінням по краях. У більш пізні терміни (через 48 годин) колонії збільшуються в розмірі (до 3-4 мм), стають слизовими, з чорним центром і добре окресленим краєм. На лужної пептонній воді вже через 6-8 годин зростання з`являється тонка, ніжна плівка, добре помітна на стінці пробірки при невеликому її нахилі. Накопичення холерних вібріонів йде швидко, тому пептонна вода як елективна серед широких використовується в ранній діагностиці холери. Холерний вібріон може диссоциировать, переходячи з S-форми в R-форму. R-форми холерного вібріона на пептонній воді утворюють грубу, іноді суху зморшкувату плівку. Холерний вібріон дуже активний в біохімічному відношенні. Ферментує з утворенням кислоти без газу глюкозу, левулезу, галактозу, сахарозу, мальтозу, манозу і крохмаль, залишаючи без зміни лактозу, арабинозу, дульцит. На желатині при посіві уколом зростання представляється у вигляді білої лінії, потім настає її розрідження з поверхні у вигляді бульбашки (див. Рис. 81). Утворює індол, аміак і сірководень, відновлює нітрати в нітрити.
Холероподобние вібріони. У навколишньому нас природі (вода, земля), у людей (в роті і кишечнику) і тварин зустрічаються вібріони, морфологічно і біологічно подібні з холерним вібріоном. Ці холероподобние вібріони не володіють патогенностью, але вони можуть утруднити бактеріологічну діагностику холери. Більшість холероподібних вібріонів на відміну від холерних гемолізує баранячі еритроцити і не розкладає крохмалю. Диференціюються ознакою є також здатність холерного вібріона ферментувати манозу, сахарозу, залишаючи без змін арабинозу. Для точної диференціації холерних вібріонів від холероподібних треба використовувати реакцію аглютинації зі специфічною сироваткою і поставити досвід з холерним бактериофагом (на лізіруемость виділеної культури).
Антигенна структура і серологічні типи. Холерний вібріон володіє двома антигенами: соматичним термостабільним О-антигеном і жгутиковим термолабільних Н-антигеном. Холерні вібріони відрізняються від холероподібних вібріонів тільки О-антигеном. Тому для диференціації потрібно користуватися аглютинативна О-сироватками, які агглютинируют тільки холерні вібріони. Японські автори поділяють холерний вібріон на три серотипу: I (тип Інаба), II (тип Огава) і III (тип Гікошіма). У 1962 р за рекомендацією Всесвітньої організації охорони здоров`я (ВООЗ) до холерним вібріонам віднесений і вібріон Ель-Тор. Свою назву цей вібріон отримав від карантинної станції Ель-Тор в Африці, де він вперше був виділений в 1905 р від хворого з клінічною формою холери і описаний в 1906 р Р. Готшліхом.
Вібріон Ель-Тор відрізняється від класичного холерного вібріона тим, що гемолізує еритроцити барана і кози в рідкому середовищі (проба Грейга), викликає гемаглютинацію еритроцитів курки, стійкий до антибіотика поліміксину. Однак зустрічається такий різновид вібріона Ель-Тор, яка подібно до класичного вібріон не є гемолізує еритроцитів барана. Подібність і відмінність між холерними вібріонами представлені в табл. 19.
Резистентність. Стійкість холерних вібріонів невелика: нагрівання при 56 ° вони витримують не більше півгодини. До дії дезінфікуючих розчинів вельми чутливі: 3% розчин карболової кислоти вбиває їх через 3-5 хвилин, розчин сулеми 1: 1000 - через 10 хвилин. Особливо чутливі холерні вібріони до дії кислот: соляна і сірчана кислоти навіть в розведенні 1: 100 000 вбивають їх протягом декількох секунд.

Таблиця 19
Диференційно-діагностичні ознаки холерних вібріонів

Патогенність для тварин і токсінообразованіе.
У природних умовах на холеру хворіють тільки люди. Тварини мають видовий несприйнятністю до холери. І. І. Мечникову вдалося заразити кроликів-шмаркачів, змащуючи соски годує самки культурою холерного вібріона. У тварин з`являлися симптоми ураження тонкого кишечника, що нагадують холерний ентерит у людини. Д. К. Заболотний експериментально викликав холероподобное захворювання у ховрахів, вигодовуючи їх культурою холерного вібріона.
У патогенезі захворювання велика роль належить ендотоксину і продуктам життєдіяльності вібріона. Ендотоксин складається з двох компонентів:
а) термолабільного глюцідоліпоідного, що викликає гіперемію кишечника і б) термостабильного фосфолипидного, що обумовлює гіпотермію (зниження температури тіла). У фильтратах кишкового вмісту і випорожненнях знаходяться токсичні фактори, серед яких найбільше значення мають два: 1) інгібує реабсорбцію натрію з кишкового каналу в кров- 2) кадаверин - підвищує проникність капілярів кишечника для токсичних речовин холерного вібріона.
Патогенез і клініка холери. Джерелами інфекції при холері можуть бути: а) заразилися холерою люди, які виділяють холерних вібріонів з випорожненнями вже в кінці інкубаційного періоду і в періоді продромальних явищ- б) хворі з різними формами холери- в) реконвалесценти- г) здорові вібріононосії. Зараження холерою відбувається через рот при вживанні інфікованих харчових продуктів, води або в результаті контакту з хворою людиною, яка з випорожненнями і блювотними масами виділяє велику кількість холерних вібріонів. В цьому випадку холерний вібріон заноситься в рот забрудненими руками при догляді за хворим і при зіткненні з різними предметами, що містять виділення хворих (предмети домашнього вжитку, забруднена білизна і т. Д.). Кислий вміст шлунку цьому перешкоджає для подальшого просування холерних вібріонів по травному тракту. Однак у випадках зниженої кислотності шлункового соку, ахілії, при рясному питво або наявності вібріонів всередині харчових грудок вони можуть пройти через згубний для них кислий бар`єр шлунка і потрапити в дванадцятипалу кишку, а потім в тонкий кишечник. У кишечнику холерні вібріони знаходять лужне середовище і велика кількість продуктів
розпаду білка, що дає їм можливість швидко розмножуватися.
Одночасно відбувається розпад мікробних клітин зі звільненням ендотоксину, який некротизуючим епітелій кишечника. Через лімфатичні і кровоносні судини пошкодженої слизової оболонки кишечника ендотоксин і продукти життєдіяльності холерних вібріонів надходять в кров і зумовлюють весь симптомокомплекс захворювання на холеру - пронос, блювоту, порушення водно-сольового обміну, важкі явища з боку серцево-судинної і нервової системи, загальну інтоксикацію. Інкубаційний період при холері короткій- від 1-2 до 5 днів. Захворювання зазвичай настає раптово. За клінічним перебігом захворювання розрізняють наступні форми холери:

1. холерний ентерит (холерний пронос або діарея). Це легка форма холери. Рідкий стілець і блювота при цій формі захворювання можуть бути однократними, а зневоднення майже не спостерігається. Самопочуття хворого задовільний. Тривалість хвороби зазвичай обмежується 1-2 днями;
2. холерний гастроентерит. Це форма холери з середньою тяжкістю перебігу. Починається гастроентерит найчастіше раптово з появи профузного проносу, який стає все більш частим до 15-20 разів на добу. Стілець хворого, з плаваючими в ньому обривками некротизированного епітелію, нагадує рисовий відвар. Потім до проносу приєднується блювота. В результаті організм хворого різко зневоднюється, з`являються судоми окремих груп м`язів, голос стає хриплим, температура тіла знижується. Самопочуття хворих погане. Вони скаржаться на нездужання, різку слабкість, сухість у роті і спрагу;
3. холерний алгід. Це найважча форма холери. Клінічні явища ті ж, що і при гастроентериті, але більш різко виражені. Втрата рідини може досягати 8-10% від ваги хворого. Шкіра зневоднюється, холодна на дотик, втрачає тургор і збирається в складки. Серцева діяльність різко послаблюється внаслідок підвищення в`язкості крові, з`являється сильна задишка, ціаноз (синюшність), анурія (відсутність сечі), температура тіла знижується до 35-34 °. Смертність при цій формі захворювання найбільш висока.

Зустрічаються важкі швидкоплинні алгідная форми холери, які при відсутності проносу і блювоти в результаті різкої інтоксикації закінчуються летальним результатом (суха холера).

Патогенез, клініка і мікробіологічна діагностика холери викладені відповідно до інструкції і методичними вказівками по клінічної та лабораторної діагностики, лікування та профілактики холери.                                

Імунітет. Перенесена холера залишає досить стійкий іммунітет- повторні захворювання спостерігаються рідко. В організмі перехворілих виявляють бактеріолізини, аглютиніни, преціпітіни і бактеріотропіни.
Лабораторна діагностика. Матеріалом для лабораторного дослідження на холеру служать випорожнення і блювотні маси, предмети, забруднені виділеннями хворих, трупний матеріал, вода, харчові продукти і т. Д. Холера належить до групи особливо небезпечних інфекцій, тому забір матеріалу, його транспортування в лабораторію і саме бактеріологічне дослідження вимагають особливих запобіжних заходів. Нативний матеріал (випорожнення і блювотні маси) збирають в індивідуальне судно, ретельно промите кип`яченою водою від можливих залишків дезінфекційного розчину. На дно судна кладуть менший за розмірами посудину або стерильні листи пергаментного паперу, целофану та ін. За допомогою стерильних металевих, картонних або дерев`яних ложок виділення в обсязі 10-20 мл переносять в стерильну широкогорлую баночку, щільно закривають скляною або корковою пробкою, під яку закладено пергаментний папір. Пробку на баночці обв`язують подвійним шаром пергаментного або вощаної паперу. При відсутності широкогорлих баночок зразки виділень можна поміщати в стерильні пробірки. В цьому випадку для перенесення матеріалу використовують стерильні скляні трубочки діаметром 0,6-0,8 см і довжиною 6-8 см. Трубочку захоплюють корнцангом, зачерпують нею виділення і поміщають в пробірку, яку закривають непромокаючої пробкою.

Мал. 82. Спеціальна петля для забору матеріалу на збудника холери.

Для взяття матеріалу у хворих з вираженим гастроентеритом можна використовувати гумовий катетер, один кінець якого вводять в пряму кишку, інший опускають в банку або пробірку. Рідкі випорожнення набираються в посудину вільно або при легкому натисканні на черевну стінку. Взяти матеріал для дослідження можна також ректальними скляними трубками, ректальними ватними тампонами і спеціальної петлею. Петлі готують з алюмінієвого дроту діаметром 2-3 мм, довжиною 40-50 см, складаючи її подвійно (рис. 82). Стерильну петлю змочують стерильним фізіологічним розчином і вводять в пряму кишку на 8-10 см. Взятий матеріал засівають на живильне середовище або поміщають в консервирующую рідина. Після вживання петлі знезаражують кип`ятінням.
При постановці посмертного діагнозу беруть відрізки з верхньої, середньої та нижньої частини тонкого кишечника довжиною близько 10 см. Відрізки вирізують між двома лігатурами, накладеними на обидва кінці взятого ділянки кишечника. Жовчний міхур після перев`язки протоки витягають цілком. Взяті зразки органів трупа укладають окремо в стерильні банки з притертими скляними або корковими пробками і обв`язують зверху подвійним шаром пергаментного паперу.
До матеріалу, який направляється в лабораторію на дослідження, обов`язково додають документ, в якому вказують ім`я, по батькові, прізвище та вік хворого, місце, час взяття матеріалу і його найменування, мету дослідження, передбачуваний діагноз і т. Д. У разі необхідності пересилання матеріалу в віддалені лабораторії банки укладають в металеву тару (бікси, відра, каструлі), перекладають стружкою, папером або ватою і поміщають в дерев`яний ящик, який обв`язують, пломбують або опечатують сургучем. На кришці ящика чорнилом або фарбою роблять напис: «Верх. Обережно! »І в такому вигляді пересилають його в лабораторію з нарочним.
Для виявлення вібріононосіїв реконвалесцентам і здоровим особам, що стикаються з джерелами інфекції або заразним матеріалом, дають проносне (25-30 г сульфату магнію), щоб зібрати рідкі випорожнення з верхньої частини кишечника. Проби випорожнень поміщають в 1 ° / о пептонную воду.

Холерний вібріон поза організмом людини досить швидко гине, тому, якщо неможливо досліджувати матеріал в найближчі 3 години після його взяття, необхідно використовувати консервирующую рідина.
Склад і спосіб приготування консервантів. 1.1% лужна пептонна вода. Це середовище готується з основного розчину пептона розведенням нею дистильованою водою в 10 разів.
Для отримання основного розчину пептона змішують в ступці 100 г сухого пептона, 50 г кухонної солі і 25 г вуглекислого натрію. Цю суміш розчиняють при кип`ятінні в 1 л дистильованої води-потім додають 1 г азотнокислого калію. Розчин фільтрують через паперовий фільтр, розливають у флакони по 100 мл і стерилізують в автоклаві при 120 ° протягом 20 хвилин.
Пептонную воду розливають по пробірках (по 10 мл) і у флакони (по 50 мл) і стерилізують, довівши попередньо pH до 8,2-8,4.

1. Лужна пептонна вода з теллуратов калію. Готують робоче розведення теллурита калію 1: 1000. В 1% лужну пептони воду після автоклавування додають робоче розведення теллурита калію до кінцевої його концентрації 1: 100 000. Середовище готують перед вживанням або не раніше ніж за 24- 48 годин.

Телурит калію випускається у вигляді сухого порошку або 2% розчину у флаконах. Серії теллурита повинні бути перевірені на відсутність інгібіторної дії до холерного вібріона.

1. Лужна таурохолатовая телуритовий пептонна середовище (рідке середовище Монсурі). В 1 л дистильованої води при підігріванні розчиняють: тріптікази-10 г, хлористий натрій - 10 г, таурохолат - 5 г, карбонат натрію-1 м Доводять pH до 9,2, розливають у флакони або судини з широким горлом і загвинчуються пробками, автоклавують при 1,5 атм протягом 15 хвилин і додають телурит калію в кінцевій концентрації 1: 100 000.
2. Консервант Венкатрамена - Рамакришнан. Готують основний розчин. У 80 мл гарячої дистильованої води розчиняють 12,4 г борної кислоти і 14,9 г хлористого калію, охолоджують і доводять до 1 л. З основного готують робочий розчин наступним чином: 250 мл основного розчину змішують з 133 мл 0,8% розчину їдкого натру, перемішують, доводять до 1 л дистильованою водою і додають 20 г висушеної морської солі. Доводять pH рідини до 9,2, фільтрують через паперовий фільтр, розливають по 10 мл в широкогорлі склянки з пригвинчувався пробками і стерилізують в автоклаві 15 хвилин при 120 °.

Етапи мікробіологічного дослідження. Етап I. а) Бактериоскопическое дослідження. З доставленого в лабораторію матеріалу (випорожнення, блювотні маси) готують кілька мазків, висушують на повітрі і фіксують рідким фіксатором (етиловий спирт, суміш Нікіфорова). Фіксація жаром не рекомендується. Частина мазків фарбують водним фуксином, іншу - по Граму. В забарвлених препаратах при мікроскопірованіі поряд з типовими формами холерного вібріона у вигляді тонких і вигнутих паличок можна зустріти кокковидной спіралеподібні форми і палички, подібні з мікробами кишково-тифозної групи. Результат бактеріоскопічного дослідження є лише орієнтовним.
б) Бактеріологічне дослідження. Випорожнення, блювотні маси ретельно перемішують і роблять первинний посів на одну з рідких поживних середовищ і на тверді поживні середовища. Як рідких середовищ збагачення рекомендується 1% лужна пептонна вода, 1% пептонна вода з телуриту калію і рідке середовище Монсурі. Середовища з телуриту є ингибирующими і при малих посівних дозах можуть затримати розмноження холерного вібріона. Як тверді поживних середовищ використовують паралельно лужний агар і одну з селективних середовищ (агар TCBS, середа Аронсона, середа Монсурі). Від хворих з важкою формою холери і від трупів в середу накопичення досить посіяти 0,1-0,2 мл випорожнень, при легких формах захворювання 0,5-1 мл і від здорових - 2-3 г випорожнень.
Посіви інкубують в термостаті при температурі 37 ° на лужної пептонній воді 6-8 годин, на пептонній воді з телуриту калію 12-24 години, на лужному агарі 10-12 годин, а на селективних середовищах 12-24 години.
Бактеріологічне дослідження триває в наступних 6 етапах.
Етап II. 1. Переглядають посіви на 1-й середовищі накопичення, вивчають характер росту на ній.
При зростанні холерного вібріона на рідкому поживному середовищі вже через три години з моменту посіву відзначається легка опалесценція, а через 6 годин можна спостерігати появу тонкої ніжної плівки, добре помітною на стінці пробірки при невеликому її нахилі. У більш пізні терміни (через 8-12 годин) утворюються чітко видима синюватий наліт (при виділенні вібріонів класичного типу) або плівка білуватого кольору (при виділенні вібріонів біотипів Ель-Тор). У процесі розвитку епідемічного спалаху холери, а також в результаті лікування хворих антибіотиками можуть виникнути шорсткі варіанти холерного вібріона (R-форми), що утворюють на поверхні рідкого живильного середовища грубу, щільну або суху, зморшкувату плівку.

1. З поверхневої плівки на 1-й середовищі накопичення готують мазки, забарвлюють і мікроскопують. При виявленні бактерій, схожих з холерним вібріоном, визначають їх рухливість в препаратах висячої і роздавленої краплі або шляхом посіву уколом в 0,3% напіврідкий агар глибиною на 2-2,5 см.
2. При наявності достатньої кількості вібріонів ставлять реакцію іммобілізації з О-сироваткою в фазово-контраст освітленні або темному полі.
3. Проводять пересівши з 1-й середовища накопичення на 2-ю шляхом перенесення приблизно 0,1-0,5 мл середовища поверхневого шару в пробірку з 5-10 мл. тієї ж середовища.

6. З поверхневої плівки роблять висів на агарові середовища. Посів на чашки роблять петлею діаметром 5-6 мм, торкаючись нею тільки поверхневого шару рідини.
Етап III. 1. Вивчають зростання на 2-й середовищі накопичення і роблять висів з неї на агарові середовища. З 2-ї середовищем накопичення виробляють ті ж дослідження, які на

1. етапі виконують з 1-й середовищем накопичення.
2. Переглядають чашки з посівами нативного матеріалу і відбирають колонії, підозрілі щодо холерного вібріона.
3. Відібрані колонії відсіваються на лактозо-сахарозному середу.
4. Матеріал інших колоній з ознаками, типовими для холерного вібріона, використовують для прискореної ідентифікації виділених мікробів.

Попередня ідентифікація холерних вібріонів проводиться, виходячи з морфології мікробної клітини, морфології колоній і орієнтовною реакції аглютинації на склі з холерної О-сироваткою в розведенні 1: 100 і типоспецифічними сироватками в розведенні 1:50.
При наявності характерних для холерних вібріонів ознак дають попередню відповідь про позитивний результат дослідження.
Етап IV. 1. Продовжують вивчення колоній. З посівів, зроблених на лактозо-сахарозному середу, відбирають культури, що розщеплюють сахарозу без газу і неферментуючі лактозу (почервоніння середовища в стовпчику без утворення газу), для остаточної їх ідентифікації.
Остаточна ідентифікація холерних вібріонів проводиться на підставі морфології ітинкторіальних властивостей мікробної клітини, культуральних властивостей, біохімічної активності, агглютінабельності видовий і типоспецифічними сироватками та чутливості до діагностичних фагів.

1. Проводять перегляд чашок з висівом з 1-й пептонною води, відбір і вивчення колоній, підозрілих щодо холерного вібріона (див. Етап III, пункт 2).
2. Облік результатів прискореної ідентифікації, проведеної на етапі III.

Етап V. 1. Облік остаточної ідентифікації культури, виділеної з посіву нативного матеріалу. при
Холерні вібріони з типовими властивостями викликають в середовищах Гісса з манозу і сахарозою утворення кислоти без газу і не розкладають Арабіноза. Ознака ферментації вуглеводів не є специфічним тільки для холерних вібріонів і оцінюється в поєднанні з іншими діагностичними ознаками, в першу чергу з серологічними.
Протеолітичні властивості виділених культур враховуються на 2-3-ю добу. Холерний вібріон викликає характерне воронкообразное розрідження желатини з бульбашкою повітря в верхній частині (див. Рис. 81). Однак зустрічаються такі холероподобние вібріони, які дають таку ж картину розрідження желатини.
Визначення антигенних властивостей. Антигенні властивості виділеної культури визначають, як це було зазначено вище, на предметному склі або в розгорнутій аглютинації в пробірках. Цільну агглютинируют холерну О-сироватку (суху попередньо розчиняють в 1 мл дистильованої води) розводять фізіологічним розчином, починаючи з 1: 50 до титру. До 0,5 мл кожного отриманого розведення сироватки додають по 0,5 мл суспензії досліджуваної мікробної культури, що містить 1 млрд. Мікробних тіл в 1 мл по холерного стандарту каламутності або 500 млн. По бактеріального стандарту ГКІ № 5. Таким чином, величина розведення сироватки подвоюється. Останнє розведення повинно відповідати титру сироватки, вказаною на етикетці. Реакція аглютинації, як зазвичай, супроводжується контролем антигену і контролем сироватки. Після перемішування вмісту пробірок шляхом струшування штативів останні поміщають на 2 години в термостат при температурі 37 °. Після закінчення зазначеного терміну виробляють попередній облік результатів. Остаточний облік результатів проводять через 20 годин витримування пробірок при кімнатній температурі. Оцінка отриманих результатів ведеться за загальноприйнятою методикою.
Для визначення серотипу холерного вібріона ставлять реакцію аглютинації на склі з типовими сироватками Інаба і Огава, розведеними 1: 50, з контролем антигену в краплі фізіологічного розчину. При позитивній орієнтовною реакції аглютинації ставлять розгорнуту реакцію з тієї ж сироваткою, розведеною до титру.
Диференціацію між вібріонами класичного типу і вібріонами Ель-Тор проводять на підставі лізіруемості культур діагностичними бактеріофагами С і Ель-тор II- чутливості мікробної культури до поліміксіну- реакції аглютинації курячих ерітроцітов- гемолізу баранячих ерітроцітов- реакції Фогес-Проскауера- гексамінового тесту.
Тести з холерними бактеріофагами. Для визначення біотипів холерних вібріонів застосовують холерні бактеріофаги С і Ель-Тор II, що випускаються медичною промисловістю в рідкому вигляді, в ампулах.
Для постановки реакції використовують чашки Петрі, залиті 1,5-2% поживним агаром pH 7,4-8,0. Після попереднього підсушування живильного середовища дно чашки ділять на сектори за кількістю 10-кратних розведень фага (починаючи від цільного до робочого) зазначеного на етикетці ампули. У пробірку з 3 мл 6,0% агару Хоттингера, розплавленого і охолодженого до температури 46 °, додають 0,1-0,2 мл 3-4-годинний бульонной культури досліджуваного штаму вібріона, культуру ретельно перемішують і виливають на поверхню агару в чашку Петрі. Після застигання шару агар чашки підсушують 30 хвилин при кімнатній температурі і потім в центр секторів наносять петлею діаметром 2-3 мм по краплині розведень на одну чашку фагів С, на іншу - фагів Ель-Тор II. Для підсихання крапель фага чашки витримують при кімнатній температурі 15-20 хвилин, потім перевертають догори дном і поміщають в термостат при 37 °. Результати враховують через 12-16 годин, в екстрених випадках - через 4-6 годин.
Бактеріофаг З активний лише відносно класичного варіанту холери, бактеріофаг Ель-Тор II діє тільки на варіант Ель-Тор.
Чутливість до поліміксину. Чутливість мікробних культур до поліміксину визначається за допомогою посіву досліджуваної мікробної культури на чашки поживного агару pH 7,6, що містить полимиксин М або В, з розрахунку 50 ОД антибіотика на 1 мл середовища.
Результати зростання враховують після інкубації посівів при температурі 37 ° протягом 18 годин. Вібріони Ель-Тор ростуть на поліміксіновой середовищі, класичні холерні вібріони на ній не ростуть.

Реакція гемаглютинації з курячими еритроцитами. На предметне скло поміщають краплю фізіологічного розчину і розтирають в ній петлю 18-годинний агарної культури досліджуваних вібріонів до отримання густої суспензії, потім додають краплю 2,5% суспензії курячих еритроцитів, відмитих двічі фізіологічним розчином. Суспензія еритроцитів і вібріонів змішують легким погойдуванням скла. Реакція супроводжується двома контролями - 2,5% суспензією еритроцитів, розмішати в краплі фізіологічного розчину (контроль еритроцитів), і суспензією випробовуваних вібріонів в краплі фізіологічного розчину (контроль антигену).
При позитивному результаті реакції (при негативних контролях) склеювання еритроцитів відбувається протягом хвилини.
Холерні вібріони біотипів Ель-Тор агглютинируют курячі еритроцити, класичні холерні вібріони не викликають їх аглютинації.
Гемоліз баранячих еритроцитів (проба Грейга). До 1 мл добової культури випробовуваних вібріонів, вирощених на бульйоні Мартена або Хоттингера, додають 1 мл 1% суспензії стерильно взятих еритроцитів барана. Суміш культури і еритроцитів обережно перемішують і поміщають на 2 години в термостат при 37 °, а потім до наступного дня витримують в холодильнику. Після цього враховують результат реакції. Розчинення еритроцитів (лакова кров) при відсутності гемолізу в контрольній пробірці (суспензія еритроцитів в стерильному бульйоні) відзначається як позитивний результат реакції.
Ознака гемолізу не є специфічним тільки для холерних вібріонів, так як багато нехолерной вібріони мають здатність викликати гемоліз еритроцитів.
Реакція Фогес-Проскауера. Реакція полягає в здатності мікробної культури утворювати ацетілметілкарбінол. Для її виявлення досліджувану культуру засівають в глюкозо-фосфатний бульйон Кларка (0,5 г пептона, 0,5 г глюкози і 0,5 г фосфорнокислого калію розчиняють в 100 мл дистильованої води). Після 1-3 діб інкубування посіву в термостаті при температурі 37 ° до 1 мл досліджуваної культури додають 0,6 мл 2-нафтола (6% розчин в абсолютному
спирті) і 0,2 мл 4%. розчину їдкого калі. Пробірки струшують і поміщають на 1 годину в термостат.
При позитивному результаті реакції, властивому вібріонам Ель-Тор, настає рожеве або рубіново-червоне забарвлення середовища, що є наслідком освіти ацетілметілкарбінола.
Гексаміновий тест. З добової агарної культури досліджуваного вібріона роблять висів у 1 мл бульйону Хоттингера або Мартена pH 7,6. Посів інкубують в термостаті при температурі 37 ° протягом 24 годин, після чого одну петлю (діаметром 0,3 мм) мікробної суспензії переносять в 1 мл глюкозо-гексаміновой середовища. Засіяні середовища поміщають в термостат при температурі 37 °. Результати враховують через 6-24 години. Вібріони Ель-Тор протягом 6-8 годин змінюють колір середовища з зеленого в жовтий. Класичний холерний вібріон протягом цього часу не змінює кольору середовища, але колір середовища може змінитися в більш пізні терміни.
Перші три тести (лізіруемость діагностичними бактеріофагами, чутливість до поліміксину і здатність культур агглютинировать курячі еритроцити) є основними, а інші - допоміжними.
Таким чином, остаточна ідентифікація виділених мікробних культур, підозрілих на холерний вібріон, ґрунтується на комплексі ознак, пе: перерахованих в табл. 19.
Метод іммобілізації вібріонів під впливом специфічної холерної О-сироватки і типових холерних бактеріофагів. Метод іммобілізації і микроагглютинации вібріонів під впливом специфічної холерної О-сироватки і типових холерних бактеріофагів дає можливість поставити діагноз протягом декількох хвилин при концентрації збудника не менше 4,3Х10 клітин в 1 мл досліджуваного матеріалу.
Реакція іммобілізації специфічна і дозволяє дати перший сигнальний відповідь через 15-20 хвилин від початку дослідження.
Специфічна профілактика і терапія. Специфічна профілактика холери досягається імунізацією населення моновакциною з убитих фенолом холерних вібріонів. Для лікування з успіхом застосовують специфічний холерний бактеріофаг і антибіотики (тетрациклін, окситетрациклін, хлортетрациклин).

Живильні середовища для вирощування холерних вібріонів.

1. Лужний агар. До 1 л звичайного м`ясо-пептоппого агару додають 30 мл 10% розчину вуглекислого натрію, кип`ятять 45 хвилин, перевіряють реакцію (pH 7,8-8,0), розливають по флаконах і пробірках і стерилізують в автоклаві 20 хвилин при 120 °. Термін зберігання 3 місяці в прохолодному місці.
2. Бакто-агар TCBS. Суха середовище для діагностики холери (pH 8,6). На 1 л дистильованої води беруть 89 г сухого середовища, нагрівають до кипіння (до повного розчинення). Середовище, не стерилізуючи, розливають в чашки. Супутня мікрофлора на цьому середовищі, як правило, не росте, за винятком деяких видів протея, що утворюють колонії темно-жовтого кольору.
3. Середа Аронсона. М`ясо-пептони 3% агар проварюють протягом 4-5 годин в апараті Коха. До 100 мл гарячої середовища додають 5-6 мл 100% розчину безводної вуглекислої соди і стерилізують 10-15 хвилин при температурі 100 °, після чого до 100 мл гарячої середовища додають 5 мл 20% розчину сахарози і 5 мл 20% розчину декстрину, попередньо простерилізованого в автоклаві або фільтрацією, 0,4 мл насиченого спиртового розчину основного фуксину і 2 мл свіжоприготованого 10% розчину сульфіту натрію, попередньо простерилізованого кип`ятінням. Готове середовище остуджують до температури 45-50 °, розливають по чашках.
4. Середа Мон сура (лужна таурохолатовая телуритовий желатиновая середа). В 1 л дистильованої води в киплячій водяній бані спочатку розчиняють 10 г хлористого натрію і 15 г агар-агар, потім, часто помішуючи, тріптікази - 10 г, таурохолата натрію - 5 г, карбонату натрію - 30 г і желатин Діфко - 1 м доводять pH до 8,5, розливають по 20 мл в колби з притертими пробками і стерилізують при 1,5 атм. 15 мііут. Середу зберігають в прохолодному місці.

Перед розливом її в чашки додають телурит калію в концентрації 1: 200 000. Чашки із середовищем можна використовувати протягом 5 днів. Колонії протея на цьому середовищі мають сіруватий центр і помутніння країв у них не спостерігається.

1. Лактозо-сахарозному (поліуглеводная) понеділок. В 1 л дистильованої води при підігріванні розчиняють: пептона - 0,5 г, хлористого натрію - 0,5 г, лактози-1 г, сахарози - 0,1 г, агар-агар - 1 м Додають індикатора Андреде 4 мл, встановлюють pH - 7,4, розливають в пробірки високим стовпчиком і стерилізують в автоклаві при температурі 112 ° С протягом 20 хвилин. Готове середовище після стерилізації скошується як середовище Ресселя і посів на неї роблять за загальноприйнятої методиці.

Холерні і холероподобние вібріони, розщеплюючи сахарозу, дають почервоніння в стовпчику без утворення газу. Дизентерійні і тифо-паратіфозние бактерії не змінюють кольору середовища. Кишкова паличка утворює кислоту з газом як в стовпчику, так і в скошеному ділянці середовища.

1. Глюкозо-гексаміновий бульйон. Кристалічний гексамін (уротропін) в кількості 1 г додають до 100 мл поживного бульйону pH 7,1. В іншій флакон з 100 мл такого ж бульйону додають 1 г глюкози. Обидва 1% розчину стерилізують шляхом фільтрації через бактеріальні свічки і зберігають при температурі 10 °. Перед постановкою реакції від 100 мл розчину глюкози стерильно беруть 50 мл і додають 50 мл розчину гексамін. на

100 мл глюкозо-гексамінового бульйону додають 0,1 мл 1,6% спиртового розчину індикатора бромтимолового синього, Середовище повинне мати трав`янисто-зелений колір.

1. середа Кодама. У 100 мл води розчиняють 1 г пептона, 0,5 г розчинної крохмалю, встановлюють pH 7,4, розливають в стерильні пробірки по 5 мл і стерилізують дрібно при температурі 100 ° С протягом 3 днів по 20 хвилин.