Збудник туберкульозу - мікробіологія з технікою мікробіологічних досліджень
Мікобактерія туберкульозу була відкрита Кохом в 1882 р
Морфологія і тинкторіальних властивості. Тонкі, часто вигнуті палички, що мають довжину від 1,5 до 4 мк і товщину від 0,3 до 0,4 мк. Схильні до поліморфізму. В забарвлених препаратах представляються то у вигляді тонких, прямих або злегка вигнутих паличок, то зернистими або у вигляді ланцюжків, що складаються з зерен (рис. 87 на вклейці).
Мал. 87. Туберкульозні бактерії в мокроті при фарбуванні за Цілем - Нільсеном.
Мал. 89. Мікобактерії туберкульозу. Зростання на картопляної середовищі.
Крім кислотостійких, зустрічаються і некіслотоупорние форми туберкульозних мікобактерій. Особливо слід відзначити кіслотоподатлівие грампозитивні зерна Муха, вільно лежать у вигляді невеликих груп або укладені в тілах бактерій.
У туберкульозної мікобактерії описані невидимі форми, що фільтруються через бактеріальні фільтри. При введенні тваринам ці форми переходять в типові кислотостійкі.
Культуральні властивості. Туберкульозні мікобактерії - аероби, температурний оптимум 37 °. Зростання на поживних середовищах повільний. Ледь помітний ріст спостерігається з 8-10-го дня і досягає повного розвитку через 3-4 тижні. Паличка найкраще росте на середовищах з додаванням гліцерину і на яєчних середовищах (Петрова, Петраньяні і ін.). Колонії на гліцериновому агарі мають вигляд сухих білуватих колоній. Поступово колонії розростаються, зливаються і утворюється сухий зморшкуватий наліт, забарвлений в слабо жовтий колір.
Мал. 88. Мікобактерії туберкульозу. Зростання на картопляної середовищі.
На гліцериновому бульйоні туберкульозні мікобактерії ростуть на поверхні у вигляді сухої ламкою плівки, на картоплі - у вигляді бородавчастих утворень сіруватого кольору (рис. 88). Більш рясний і швидке зростання досягається на яєчних середовищах. Найбільш поширеними живильними середовищами для культивування туберкульозних мікобактерій є наступні.
Гліцериновий бульйон і агар. Ці середовища готують зі звичайного бульйону і агару з додаванням 4-5% гліцерину.
Згорнута яєчна середу. Свіжі яйця очищають, промивають водою, а потім спиртом. Жовток поміщають в стерильний посуд, куди додають фізіологічний розчин в таких пропорціях: 60% жовтка і 40% фізіологічного розчину. Після змішування розливають в стерильні пробірки і згортають в скошеному положенні в апараті Коха протягом 2 днів (1-й день при 72 ° протягом півгодини, 2-й день при 72 ° протягом 1 години). Перевіряють середу на стерильність. При засіву ватяні пробки слід парафінованих для захисту середовища від висихання.
Середа Петрова. Для приготування середовища необхідно підготувати в асептичних умовах наступне:
- 250 г желатину подрібнюють в стерильній м`ясорубці і додають 212 мл дистильованої води і 37,5 мл гліцерину. Суміш поміщають в льодовик на ніч, після чого фільтрують через стерильну марлю.
- Свіжі яйця (15-20 шт.) Ретельно миють водою зі щіткою і поміщають на 15 хвилин в 70 ° спирт для дезінфекції. Потім в асептичних умовах змішують жовток з білком.
- Спиртовий 1% розчин генціанвіолета.
Відео: Завод Артлайф ВАК лабораторія Як проводиться ВАК аналіз
При приготуванні середовища зазначені інгредієнти змішують в таких пропорціях: першого 200 мл, другого 400 мл і третього 0,5-1 мл. Середовище розливають в пробірки або чашки і 3 дні поспіль
згортають в апараті Коха по 30 хвилин: в 1-й день до 85 °, у 2-й і 3-й до 75 °. Середа фіолетового кольору, колонії туберкульозних бактерій жовтуваті. Якщо потрібно зберегти культуру в лабораторних умовах, середу готують без додавання фарби.
Середа Петраньяні. До 150 мл молока додають 6 г картопляного крохмалю і 1 г пептона і нагрівають, весь час помішуючи, на водяній бані до розчинення, потім додають одну дрібно нарізану картоплину (завбільшки з куряче яйце) і кип`ятять до утворення клейстеру, після чого ще одну годину підігрівають на слабкому вогні. За охолодженні до 50 ° додають суміш з 2 цільних яєць, 1 жовтка, 12 мл гліцерину і 10 мл 2% водного розчину малахітової зелені, добре збовтують, фільтрують через марлю, розливають по пробірках, скошують і дрібно стерилізують 1-й день 20 хвилин при 80 °, 2-й і 3-й день-15 хвилин при 75 °. Приготована середовище має рівномірну зеленувате забарвлення з достатньою кількістю конденсаційної води. Колонії туберкульозних бактерій чітко виділяються на зеленому тлі середовища. Зростання бактерій настає на 10-30-й день.
Гліцериновий картопля по Павловському. Картопля промивають у воді, очищають і кладуть в 1% розчин сулеми на 30 хвилин, промивають 12 годин на проточній воді. Ножем або пробійником для пробок роблять з картоплі циліндри, розділяючи їх по діагоналі. Косо зрізаний картопля поміщають в широку пробірку з перетяжкою внизу або наколюють на сірник так, щоб картопля не торкався до дна пробірки. На дно пробірки наливають 1 мл 5% розчину гліцерину. По можливості швидко стерилізують.
Резистентність. Туберкульозні мікобактерії стійкіші, ніж всі інші неспороносні бактерії. Вони добре витримують висушування. Пряме сонячне світло вбиває їх через 45-50 хвилин, розсіяний - через 8-10 діб. При нагріванні в рідинах вони гинуть при 60 ° через 15 хвилин, а при 70 ° - через 3 хвилини.
З дезінфікуючих засобів для знезараження виділень хворих при туберкульозі можуть бути використані хлорне вапно і хлорамін. Хлорне вапно в сухому вигляді застосовують для дезінфекції рідких субстратів (мокротиння, сеча, кал). Хлорно-вапняне молоко вживають у вигляді 10 і 20% суспензії хлорного вапна у воді, освітлений розчин хлорного вапна - у вигляді 1 і 3% розчину, хлорамін вживають в 3 і 5% розчинах. Предмети, що містять туберкульозні палички, опускають на 2-3 години в 3% розчин хлораміну.
Типи туберкульозних мікобактерій. Розрізняють три типи туберкульозних мікобактерій: людський тип (typus humanus), бичачий тип (typus bovinus) і пташиний тип (typus avium). Ці різновиди близькі між Собою, але відрізняються один від одного низкою особливостей.
У патології людини основна роль належить туберкульозної мікобактерії людського і бичачого типу.
Існує ряд ознак, що дозволяють відрізнити збудника людського туберкульозу від збудника бичачого туберкульозу. Мікобактерія туберкульозу людського типу довше і тонше палички бичачого туберкульозу. На штучних поживних середовищах збудник бичачого туберкульозу зростає значно повільніше і дає більш убогий зростання, не потребує гліцерині. Людський тип туберкульозної палички патогенен головним чином для морської свинки, до типу бичачому чутливі багато ссавців (велика рогата худоба, морські свинки, кролики, кози, собаки і ін.).
Патогенез і клініка туберкульозу. Джерелом інфекції є хворі люди, тварини (велика і дрібна рогата худоба) і птиці. Туберкульозні палички виділяються від хворих з мокротою (при легеневій формі захворювання), з випорожненнями (при кишковій формі) і з сечею (при ураженні сечових шляхів). Зараження туберкульозом найчастіше відбувається повітряно-крапельним шляхом. Мікобактерії туберкульозу можуть потрапити в легені з пилом, в кишечник з молоком від хворих корів. Можливе зараження прямим і непрямим контактом, через шкіру і слизові оболонки.
При зараженні туберкульозом в організмі розвиваються характерні патологоанатомічні освіти, так звані горбки (tuberculum- горбик). Звідси і виникла назва процесу - туберкульоз, або бугорчатка. Освіта горбків є прояв фагоцитарної реакції організму на фосфатиди, що містяться в тілі туберкульозної мікобактерії. У центрі горбка знаходяться туберкульозні палички, часто укладені всередині гігантських клітин. При сприятливому лікуванні горбок ущільнюється, просочується солями вапна, і настає його петрифікація (скам`яніння). Туберкульозні мікобактерії довгі роки залишаються життєздатними усередині горбків, підтримуючи постійну можливість загострення туберкульозного процесу при ослабленні організму.
Клінічні прояви туберкульозу різноманітні. Це пов`язано з місцем ураження, вірулентністю мікроба і стійкістю макроорганізму. У людей найчастіше буває легенева, форма туберкульозу, але на туберкульоз
може дивуватися будь-яка тканина (кісткова тканина, нирки, суглоби, очі і т. д.).
Туберкульоз зазвичай протікає як хронічне захворювання, але у випадках проникнення з первинного вогнища в кров великої кількості туберкульозних мікобактерій він приймає гостру міліарну форму.
Симптоми туберкульозу (лихоманка, схуднення і т. П.) Обумовлюються тим, що в організм з туберкульозних вогнищ потрапляють отруйні продукти, що виробляються туберкульозними бактеріями.
Туберкулін. Туберкульозні палички містять білкова речовина - туберкулін, який вперше був отриманий Кохом. Існує кілька препаратів туберкуліну. Старий Коховський туберкулін (альттуберкулін) - прозора, темно-коричневого кольору рідина - являє собою фільтрат вбитої стерилізацією 6-8-тижневої культури туберкульозних мікобактерій на гліцериновому бульйоні і випарованої до 1 10 обсягу на водяній бані. Фільтрат містить продукти життєдіяльності і екстрактивні речовини збудника туберкульозу. На відміну від мікробних токсинів туберкулін надає отруйну дію тільки на організм туберкульозного хворого і не діє на здоровий. Туберкулін широко застосовують для діагностики туберкульозу за допомогою реакцій Пірке і Манту (алергічні реакції). Воднорастворімие білки туберкульозних бактерій є алергенами і викликають стан алергії.
Проба Пірке. На оброблену ефіром або бензином шкіру передпліччя наносять три поверхневі скарификации (спеціальним Борчик або ланцетом). При цьому слід уникати появи крові. На дві з них наносять по краплині туберкуліну, на третю (контрольну) - краплю 0,5% розчину фенолу. При позитивній реакції там, де завдано туберкулін, через 12-24- 48 годин з`являється папула з гіпереміческімі віночком. Контрольна скарифікація при правильній техніці не виявляє реактивних явищ.
Реакція Манту. Цю реакцію ставлять, вводячи строго під шкіру 0,1 мл розведеного 1: 1000 туберкуліну. Реакцію найкраще проводити на передпліччя. Шкіру фіксують знизу лівою рукою і голку шприца вводять
в товщу шкіри паралельно поверхні. Облік реакції проводять через 48 годин. Поява на місці уколу папули не менше 10 мм в діаметрі вказує на позитивний результат.
Останнім часом для цих реакцій застосовують очищений білковий препарат (PPD).
Імунітет. Людський організм має відомої ступенем вродженої несприйнятливості до туберкульозу. Про це свідчать клінічні спостереження, згідно з якими туберкульозне інфікування в ранні роки закінчується видужанням серед значних мас населення. В основі імунітету при туберкульозі лежать зміни клітинної реакції організму.
Туберкульозні мікобактерії дуже довго залишаються життєздатними в осередках (горбках), що призводить до так званого «нестерильному», або «інфекційного», імунітету.
Однак деяка частина дорослого населення залишається вільною від ранньої туберкульозної інфекції. У цих осіб можуть виникнути первинні форми туберкульозного захворювання, особливо при погіршенні матеріально-побутових умов. Тому специфічна профілактика туберкульозу має значення не тільки для дітей, а й для дорослих. У сироватці туберкульозних хворих виявлені аглютиніни, преціпітіни, лізину і комплементсвязивающіе антитіла.
Однак ці антитіла в механізмі протитуберкульозного імунітету ролі не грають.
Лабораторна діагностика. Мікробіологічний діагноз ставиться для розпізнавання туберкульозного захворювання у людини і тварин, для знаходження туберкульозного мікроба в харчових продуктах (наприклад, в молоці, сирі) і в навколишньому середовищі (наприклад, в пилу). Лабораторному дослідженню піддаються мокрота, гній, сеча, спинномозкова рідина, кал і т. Д. Крім того, для дослідження на наявність туберкульозних мікобактерій у хворих беруть промивні води шлунка і бронхів, слиз з горла (слиз знімають спеціальним тампоном).
Дослідження мокротиння на туберкульозні палички виробляється шляхом бактеріоскопії мазків, отриманням чистих культур і зараженням піддослідних тварин. З мокротиння готують препарат і забарвлюють його за Цілем-Нільсеном. При цьому на синьому тлі видно по
ліморфние рубіново-червоні мікобактерії. Невиявлення паличок туберкульозу при ретельному огляді всього пофарбованого препарату не виключає можливості наявності їх в досліджуваній мокроті. У таких випадках вдаються до методу накопичення.
Спосіб цей полягає в наступному. Мокротиння змішують з рівним або подвійним об`ємом антиформін (суміш розчину Natrii hypochlorosi і NaOH) і енергійно струшують, а потім залишають на 15-30 хвилин до повної гомогенізації. При цьому всі клітинні елементи і сторонні мікроби розчиняються, а туберкульозні бактерії завдяки їх щелочеустойчівий зберігаються. Гомогенізований мокроту центрифугируют, осад нейтралізують 30% розчином оцтової кислоти і з нього готують мазки, які, як правило, фарбують за Цілем-Нільсеном.
В практику увійшов метод флотації. Мокротиння збирають протягом 2-3 днів і до неї додають рівний об`єм 0,5% NaOH і струшують 5 хвилин. Цю суміш підігрівають півгодини при 58 ° на водяній бані і з дна відсмоктують грубі домішки піпеткою, потім додають 0,5-г-1 мл ксилолу і доливають до 200 мл дистильованої води. Всю цю суміш струшують, відстоюють 15- 30 хвилин, причому утворюється верхній кільцеподібний білуватий пінистий шар, який відсмоктують поступово пастерівської піпеткою і переносять на предметне скло. З цього матеріалу готують мазок. Останній підсушують при 60-65 °, знежирюють ефіром, фіксують на полум`ї і забарвлюють карболовим фуксином з подальшим знебарвленням 3% солянокислим алкоголем і докрашіваніем пікринової кислотою або метиленової синню.
У разі негативного результату бактеріоскопії вдаються до бактеріологічному, методу, який в даний час став здійсненним.
Перед посівом мокротиння обробляють таким чином. Мокротиння змішують з подвійним об`ємом 6% розчину сірчаної кислоти, яка вбиває всіх бактерій, крім кислотостійких, потім за допомогою центрифугування збирають осад і 3 рази відмивають від сірчаної кислоти центрифугуванням зі стерильним фізіологічним розчином. Відмитий осад вносять піпеткою в 5-8 пробірок з живильним середовищем і добре втирають петлею в поверхню середовища. посів витримують
в термостаті 6-8 тижнів. Для запобігання від висихання пробірки герметично закривають за допомогою парафіну: ватяну пробку попередньо зовні обрізають, просувають в глиб пробірки і за допомогою пастерівської піпетки з гумовим балончиком заливають розплавленим парафіном.
Запропоновано декілька методів для прискорення бактеріологічної діагностики туберкульозу. За Прайсу, туберкульозні мікобактерії вирощуються на препаратах-мазках. На предметних стеклах готують мазки з досліджуваного матеріалу, препарати занурюють стерильним пінцетом на 5 хвилин в 10% розчин сірчаної кислоти, потім промивають зануренням в стерильний фізіологічний розчин і опускають у флакони з поживним середовищем (1 частина стерильної крові + 3 частини дистильованої води). Через 7-10 днів препарати забарвлюють за способом Циля-Нільсена і під мікроскопом виявляють мікроколонії - скупчення туберкульозних мікобактерій (рис. 89) у вигляді джгутів.
Е. А. Школьникова розробила метод глибинного посіву на кров`яну сироватку. Сутність його полягає в наступному. Патологічний матеріал (мокрота, в`язкий гній) обробляють 8-10-12% розчином сірчаної кислоти і центрифугують. Осад дворазово промивають (з центрифугуванням) стерильної дистильованої водою і засівають петлею в 3 пробірки з 5 мл спеціальної середовища (цитратна кров людини, кролика або барана, перед посівом розведена дистильованою водою 1, 2, 1 3). Посів роблять у глибину кров`яної середовища. Пробірки парафінують і ставлять в термостат при 37-38 ° на 7-10, а в разі затримки росту на 15-20 днів. Після цього вміст пробірки (кожну пробірку по часу досліджують окремо) центрифугують і осад одноразово промивають дистильованою водою. З осаду роблять мазки, фарбують за Цілем-Нільсеном і розглядають під мікроскопом.
Якщо матеріал, який підлягає дослідженню, не містить сторонньої мікрофлори (спинномозкова рідина, серозний ексудат і т. Д.), То його відразу, без попередньої обробки сірчаною кислотою, засівають на кров`яну середу.
Крім зазначених методів, застосовують і біологічне дослідження мокротиння. Для цього близько 1 мл мокротиння вводять морській свинці, найкраще під шкіру в області пахового згину. Тварини можуть передчасно загинути, якщо в мокроті знаходяться хвороботворні стрептококи або пневмококи. Тому мокроту обробляють таким чином. Ретельно струшують її в стерильній баночці з намистом, додавши 2-5 мл фізіологічного розчину, і підігрівають на водяній бані при 58 ° (не вище 60 ° С) протягом 5-8 хвилин. Обробку роблять сірчаною кислотою, так само як і для посіву, з триразовим промиванням стерильним фізіологічним розчином. Після такої обробки осад збовтують в невеликому об`ємі фізіологічного розчину і вводять морським свинкам під шкіру в області пахового згину або в м`язи стегна задньої лапки. Вже через 3 тижні після введення регіонарні залози значно збільшуються. У цей час можна вилущити одну із залоз і піддати дослідженню на присутність туберкульозних бактерій в мазках і на зрізах. Можна також шляхом пунктирування таких залоз і бактеріоскопії пунктата виявити туберкульозні палички.
Морські свинки повинні перебувати під наглядом не менше 3 місяців, після чого їх вбивають для патологоанатомічного дослідження. В позитивних випадках виявляється міліарний туберкульоз.
При дослідженні сечі на туберкульозні бактерії щоб уникнути попадання паличок смегми сечу беруть стерильно (катетером) після ретельного обмивання зовнішнього отвору уретри. Для бактеріоскопічного дослідження потрібно добова порція сечі, для бактеріологічного - ранкова. Осад, отриманий центрифугуванням, досліджують звичайним способом. Для відмінності від сторонніх кислотостійких бактерій слід зробити посів і поставити біологічну пробу.
Дослідження спинномозкової рідини проводиться наступним чином: пробірку зі свежеполученной прозорим і безбарвним ликвором відстоюють в льодовику близько 24 годин. У разі утворення за цей час тонкої і ніжної плівки (так званої павутинки) рідина обережно і повільно виливають на предметне скло, косо поставлене в скляну чашку. «Павутинку» треба затримати платинової голкою і не дати їй сповзти зі скла з струмом рідини.
Розподілену по склу плівку висушують в термостаті, фіксують (краще спиртом з ефіром), фарбують за Цілем-Нільсеном і мікроскопують. Якщо бактериоскопически туберкульозні мікобактерії виявлені не будуть, необхідно поставити досвід з зараженням морських свинок.
Специфічна профілактика туберкульозу здійснюється імунізацією дитячої групи населення вакциною БЦЖ (BCG скорочена Bacille Calmette Guerin). Ця вакцина отримана Кальметт і Герен, які протягом 13 років вирощували збудника бичачого туберкульозу на гліцериновому картоплі з додаванням жовчі. В результаті цього культура настільки втратила свою вірулентність, але це бачиться нешкідливою для тварин навіть у великих дозах. Приживаючись в організмі, такі туберкульозні мікобактерії створюють нешкідливі вогнища і тим самим нестерильний імунітет при туберкульозі.
Загальні заходи боротьби з туберкульозом. Туберкульоз і сифіліс відносяться до інфекційних захворювань, які носять яскраво виражений соціальний характер. У капіталістичному суспільстві, в якому класова приналежність визначає життєву забезпеченість, для пролетаріату створюються умови, що сприяють захворюваності на туберкульоз.
Основні заходи в боротьбі з туберкульозом в нашій країні зводяться до оздоровлення праці і побуту і до профілактики, що базується на ранньому розпізнаванні туберкульозу, виявленні бактеріовиділювачів, широкої диспансеризації, санаторно-курортному лікуванні і активної імунізації.
Лікування туберкульозу з успіхом проводиться застосуванням стрептоміцину, ПАСК, фтивазид, Тібон і туберкулостатичних препаратів, що діють на мікобактерії, стійкі до цих основних препаратів, - циклосерина, канаміцину, рифампіцину та ін.
