Набутий імунітет - мікробіологія з технікою мікробіологічних досліджень

Імунітет, що виникає в результаті інфекційного процесу або при штучному введенні в організм речовин антигенного характеру, зазвичай називають постінфекційний і відповідно поствакцинальних. І при цьому імунітеті по суті діють ті ж регуляторні механізми, що і при природному імунітеті, т. Е. Процеси виділення, фагоцитоз, реактивність організму в цілому, захисні властивості шкіри і слизових оболонок. Освіта антитіл, яке зазвичай вважають специфічною формою захисту, також можна розглядати з точки зору фізіологічних функцій організму.

АНТИГЕНИ І АнтитілА

Антигенами називаються речовини, які можуть при надходженні в організм викликати в ньому утворення антитіл.
Основною властивістю антигенів є здатність їх викликати утворення специфічних антитіл і реагувати з уже антитілами. Необхідною умовою прояви антигенного дії є: 1) чужорідність (гетерогенність) даного антигену для організму-2) введення антигену парентеральний (минувши шлунково-кишковий тракт).
Антигени бувають повноцінними і неповноцінними.
Повноцінні антигени здатні викликати утворення антитіл і вступати з ними в реакцію. Повноцінними антигенами є головним чином речовини білкової природи, причому вони повинні бути в колоїдному стані і розчинні в рідинах організму.
Неповноцінні антигени, або гаптени, вступають в реакцію з антитілами, але не здатні викликати в організмі утворення антитіл. Неповноцінними антигенами є липоиди, високомолекулярні вуглеводи і ряд інших речовин. Гаптени стають повноцінними антигенами, т. Е. Набувають здатність викликати утворення антитіл, при додаванні до них деякого, хоча б дуже незначного, кількості білка.
Бактеріальна клітина в зв`язку зі складністю її структури складається з великого числа як повноцінних антигенів - білків, так і неповноцінних антигенів - гаптенов. Рухливі бактерії володіють двома антигенами - термолабільних (напівзруйнованих при температурі 80 °), пов`язаним з джгутиками і носить назву жгутикового (Н-антигену) і термостабільним (не руйнуються при температурі 80-100 °), пов`язаним з цитоплазмою бактерій, так званим соматичним (Про -антиген). З втратою рухливості Н-антиген втрачається. При імунізації рухливими бактеріями утворюються антитіла і до того і до іншого антигену.
Одержуваний під час добування трихлороцтової кислотою з бактерій соматический антиген складається з ліпоідополісахарідопротеінового комплексу (повний антиген). У брюшнотифозной палички, у бактерій, що викликають харчове отруєння, крім Н і О-антигенів, встановлений ще один особливий антиген - антиген вірулентності (Vi-антиген). Бактерії, що утворюють капсулу, мають специфічний капсульної антигеном, який вирізняється від антигенів самої клітини.
Антитілами називаються речовини білкової природи, що утворюються в організмі при парентеральному введенні антигенів.
Антитіла характеризуються тим, що з`єднуються тільки з тими антигенами, проти яких вони вироблені організмом (специфічність антитіл):
Антитіла можуть міститися в невеликій кількості в сироватці здорових, неімунізованих людей (нормальні антитіла). Кількість аітітел в сироватці (її титр) значно збільшується в результаті інфекції або штучної імунізації.
Антитіла вступають в певну реакцію з антигеном, яка характеризується різними зовнішніми проявами. Так, при змішуванні імунної сироватки з бактеріями можна спостерігати феномен склеювання зважених в рідини мікробів з подальшим випаданням їх в осад (аглютинація), при певній постановці досвіду - розчинення мікробів (бактеріоліз). При змішуванні сироватки переніс дифтерію з токсином дифтерійної палички можна виявити нейтралізацію отруйної дії токсину (антитоксичну властивість сироватки). Імунна сироватка при взаємодії з антигенами, що знаходяться в розчиненому стані, дає реакцію осадження - преципитации. При імунізації виробляються антитіла, що підвищують фагоцитарну функцію (опсоніни і Тропіних), і антитіла, що зв`язують комплемент, а при введенні чужорідних еритроцитів в сироватці накопичуються антитіла - гемолізини, що дають гемоліз.
Таким чином, в залежності від способу дії на антиген і зовнішнього прояву реакції розрізняють такі антитіла: антитоксинів (нейтралізують токсин), аглютиніни (що викликають склеювання і осадження бактерій), бактеріолізини (розчиняють бактерій), бактерицидні (вбивають бактерій), вируснейтрализующие антитіла, преціпітіни ( викликають зі специфічним антигеном утворення осаду - преципитата), опсоніни і Тропіних (підвищують фагоцитарну функцію), гемолізини (викликають розчинення еритроцитів), комплементсвязивающіе антитіла та ін.

Механізм утворення антитіл

Антитіла утворюються тільки в організмі людини або тварини.
Існує безліч теорій і гіпотез, що пояснюють механізм утворення антитіл. Згідно з сучасними даними імунні протівотел є видозміненими глобулинами сироватки крові, що відрізняються від нормальних наявністю активних центрів, відповідальних за з`єднання з антигеном, і утворюються в лімфоїдної тканини: лімфатичних вузлах, селезінці, печінці, ендотелії судин, кістковому мозку і т. Д., Т. е. в тих же органах, де синтезуються нормальні глобуліни сироватки. Однак роль різних клітинних елементів лімфоїдної тканини в цьому процесі неоднакова. Основне значення у виробленні антитіл належить плазматичним клітинам. При імунізації сприйняття антигенного роздратування здійснюється макрофагами, які потім передають інформацію про антигене різних клітин лімфоїдної тканини, здатним утворювати специфічні глобуліни (антитіла), т. Е. Антигену належить безпосередня, що формує роль в синтезі антитіл. Цим і пояснюється специфічний характер антитіл і їх здатність з`єднуватися з антигеном як in vivo (в організмі), так і in vitro (в пробірках).
Освіта антитіл і виділення їх клітинами відбувається в дві фази. У першій індуктивної (латентної) фазі відбувається синтез антитіл, у другій-продуктивної виділення антитіл з лімфоїдних органів в кров. Активність лімфоїдної тканини стимулюється гормоном зобної залози.
Великим визнанням користується клонально-селекційна теорія Бернета. Відповідно до цієї теорії в організмі тварин і людини в нормі існують клітини, здатні синтезувати антитіла. Антиген тільки селекціонує і стимулює діяльність цих клітин.
Антитіла при захворюванні або імунізації утворюються не відразу, а після певного проміжку часу, під час якого відбувається імунологічна перебудова організму для відповідного синтезу імунних глобулінів - антитіл. Зазвичай при інфекційних захворюваннях антитіла з`являються через 5-6 днів, а при імунізації анатоксином через 2-4 тижні. Титр антитіл поступово наростає, досягаючи найбільшого показника до кінця хвороби, а при імунізації в різні терміни від 2-3 тижнів до 2-3 місяців. Потім кількість антитіл знижується, спочатку швидко, потім повільно вони прямісінько зникнути або в певній кількості залишитися в організмі. Час появи антитіл, їх титр залежать як від характеру антигену, так і від індивідуальних особливостей макроорганізму.

Реакції імунітету і техніка серологічних досліджень

Серологічний метод дослідження заснований на специфічному взаємодії імунної сироватки з відповідним антигеном (суспензія мікробів в фізіологічному розчині хлористого натрію, екстракти, токсини).
Форма прояву взаємодії антигену з антитілом різна і залежить від структури антигену і від середовища, в якій відбувається їх з`єднання. Зовнішній прояв реакції може бути у вигляді склеювання мікробів, т. Е. Аглютинації, преципітації (або осадження), розчинення мікробів (або бактеріолізу) і т. Д. Зазначені імунологічні реакції специфічні і дуже чутливі, тому серологічний метод дослідження набув широкого застосування.
Реакції імунітету широко використовуються з діагностичною метою і при виробництві лікарських сироваток і вакцин.

Реакція нейтралізації токсину антитоксином
Антитоксини це антитіла, здатні з`єднуватися з екзотоксинами і нейтралізувати їх. Антитоксичні властивості сироваток демонстративніше виявляються в експерименті на тварин, чутливих до відповідного екзотоксину. При змішуванні великих доз токсину з достатньою кількістю імунної антитоксичної сироватки настає нейтралізація токсину, і така суміш при введенні чутливого тварині не викликає хвороботворних розладів.
Нейтралізує сила сироватки відповідає кількості містяться в ній антитоксинів. Ця кількість визначається умовними одиницями. наприклад,
однією антитоксической одиницею (1 АЕ) дифтерійного антитоксину вважають ту кількість імунної сироватки, яке нейтралізує 100 мінімальних смертельних доз дифтерійного токсину (Dim - мінімальна смертельна доза, т. е. мінімальна кількість токсину, яке вбиває морську свинку вагою 250 г на 2-у добу ).
При взаємодії в пробірці специфічної антитоксичної сироватки з відповідним токсином відбувається випадання пластівчасті осаду. Це явище носить назву флоккуляции.
Для визначення сили антитоксичної сироватки Рамон запропонував використовувати явище флоккуляции. Для цього в ряді пробірок змішують певні кількості токсину з все більш зменшеними дозами антитоксичної сироватки. У пробірці, де відбувається повна нейтралізація токсину, випадає осад і просвітлення рідини настає раніше, ніж в інших пробірках - відбувається ініціальна (первинна) реакція флоккуляции.
Явище флоккуляции практично використовують в сироватковому виробництві при визначенні сили антитоксичної сироватки.

реакція аглютинації
При додаванні до суспензії бактерій гомологичной імунної сироватки настає поступове скучіваніе бактерій з утворенням видимих неозброєним оком грудочок, що складаються з бактеріальних тіл і осідають на дно пробірки. Таке явище отримало назву реакції аглютинації (рис. 53 і 54). Ця реакція з успіхом застосовується для діагностики бактеріальних інфекцій. При імунізації рухливими бактеріями виробляються аглютиніни як проти жгутикового, так і проти соматичного антигену (жгутикові або Н-аглютиніни, і соматичні, або О-аглютиніни), причому ці два типи аглютинінів мають різний характер.

Мал. 53. Реакція аглютинації при спостереженні неозброєним оком.

Мал. 54. Реакція аглютинації при спостереженні в лупу.

Мал. 55. Агглютіноскоп.

Жгутикові аглютиніни викликають швидке утворення пухких пластівців. Соматичні ж аглютиніни діють повільніше, а утворені ними скупчення бактерій мають характер дрібних зерен.
Якщо аглютинація погано помітна неозброєним оком, її можна спостерігати в агглютіноскоп (рис. 55).
Механізм аглютинації. Реакція аглютинації складається з двох фаз: перша фаза - з`єднання бактерій з агглютининами, друга - осідання бактерій під впливом електролітів.
Захисна дія агглютінінов багатьма заперечується в силу того, що обложені мікробні клітини в процесі аглютинації незазнають помітних морфологічних змін. Вони втрачають рухливість, скупчуються, але залишаються живими і можуть продовжувати розмножуватися. Можна припускати, що зібрані в купки мікроби легше фагоцитируются або піддаються впливу інших антитіл (наприклад, лізину). Таким чином, аглютиніни беруть участь в захисті організму содружественно з іншими факторами імунітету.
Реакцію аглютинації широко використовують з діагностичною метою. Реакція аглютинації специфічна, тому якщо сироватка хворого викликає аглютинацію бактерій відомого виду, то з цього випливає, що хворий, у якого взята сироватка, страждає на захворювання, викликаним мікробами того ж виду. Якщо імунна агглютинируют сироватка, отримана від тваринного, імунізованих певним видом мікроба, агглютинирует культуру збудника, виділеного від хворого, це означає, що передбачуваний мікроб і бактерії, якими проводилася імунізація, належать до одного і того ж виду.
Таким чином, в одних випадках для діагностики захворювання беруть сироватку хворого, а в лабораторії повинна бути перевірена жива чи вбита культура відповідного мікроба, в інших - досліджується мікроорганізм, виділений з організму, і відповідна імунна сироватка повинна бути в лабораторії.
Аглютиніни можуть вступати в реакцію з родинними мікроорганізмами, даючи групові реакції аглютинації. Це явище пояснюють наявністю загальних групових антигенів. Наприклад, агглютинируют брюшнотифозная сироватка в малих розведеннях склеює не тільки черевнотифозних, але і паратіфозних бактерій.
Для постановки реакції аглютинації необхідно мати: 1) сироватку хворого або діагностичну агглютинируют сироватку (отриману від імунізованих тварин) - 2) культуру мікробів або антиген 3) фізіологічний розчин кухонної солі, так як в солі середовищі (дистильованої воді) аглютинація не відбувається.
Реакція аглютинації з сироваткою хворого. Кров хворого отримують в асептичних умовах шляхом венепункції або уколу пальця, в першому випадку в кількості 2-5 мл, в другому - в кількості 1 мл. Кров залишають на 1 годину при кімнатній температурі, за допомогою пастерівської піпетки відокремлюють згусток фібрину від стінки пробірки і для кращого відстоювання сироватку поміщають в льодовик. Відстояну сироватку відсмоктують піпеткою і переносять в іншу пробірку. Пересилання сироватки виробляється в запаяній ампулі або пипетке. З отриманої сироватки готують необхідні розведення (див. Стор. 164).
Другим інгредієнтом (складовою частиною) для постановки реакції є диагностикум, т. Е. Суспензія вбитих мікробів. Готується диагностикум шляхом додавання до мікробної суспензії фенолу в концентрації 0,25-0,5% або формаліну в концентрації 0,2-0,3%.
Реакцію аглютинації ставлять в невеликих агглютінаціонние пробірках (діаметр 0,9-1 см, довжина 10 см). Використовують 6-10 пробірок, в залежності від потрібних для реакції розведень сироватки. Так як нормальні аглютиніни виявляються при незначних розведеннях сироватки, результати реакції враховують при більш високих розведеннях не нижче 1: 50-1: 100. У кожну пробірку, що містить сироватку в певному розведенні, додають 1-2 краплі бактеріальної суспензії і струшуванням ретельно перемішують вміст пробірки, поміщають в термостат на 2 години при 37 °, а потім залишають при кімнатній температурі до наступного дня.
Одночасно з досвідом в абсолютно однакових умовах ставлять контроль, т. Е. В окрему пробірку наливають 1 мл фізіологічного розчину (без сироватки), до якого додають 1-2 краплі тієї ж бактеріальної суспензії, щоб переконатися в тому, що дана культура сама по собі не випадає із суспензії у вигляді грудочок (неспецифічне явище - мимовільна аглютинація).
Позитивний результат реакції аглютинації характеризується більшою або меншою прозорістю рідини і осадом мікробів на дні пробірки. При негативному результаті рідина зберігає первинний гомогенний вигляд.
Характер аглютинації, т. Е. Тип утворюється агглютіната, може бути різноманітним. Освіта великих пластівців, які осідають на дно пробірки, характерно для крупнохлопчатой (Н) аглютинації, яка наступає в результаті склеювання бактеріальних клітин за допомогою джгутиків, і відбувається протягом 2 годин перебування пробірки в термостаті.
О-аглютиніни обумовлюють склеювання мікробвих тел, що дає компактний дрібнозернистий осад, що вистилає дно пробірки. Дрібнозерниста (О) -агглютінація протікає повільніше і враховується через 24 години (після 2-годинного перебування в термостаті і 18-20-годинного витримування при кімнатній температурі).
Облік результатів проводиться неозброєним оком при читанні крупнохлопчатой Н-аглютинації і за допомогою лупи або агглютіноскопа при виявленні дрібнозернистої О-аглютинації. Ступінь позитивної реакції позначається по четирехкрестной системі:
а) (++ + +) - рідина в пробірках прозора, дуже великий осад у вигляді парасольки - повна агглютінація-
б) (+ + +) - рідина майже прозора, осад значний - майже повна агглютінація-
в) (++) - рідина непрозора, осад невеликий - слабка агглютінація-
г) (+) - рідина непрозора, осад незначний, ледь помітний неозброєним глазом- призбовтуванні можна побачити пластівці або зернистість в лупу або агглютіноскоп - відзначаються сліди аглютинації.
Реакція аглютинації використовується при діагностиці черевного тифу (реакція Відаля), бруцельозу (реакція Райта) і інших захворюваннях.
Визначення виду мікроба методом аглютинації. Реакція аглютинації дає можливість також визначити природу невідомого мікроба і тим самим поставити діагноз. В цьому випадку чиста культура мікроба, що підлягає визначенню, піддається паралельного дослідження різними аглютинативна діагностичними сироватками. Для постановки реакції аглютинації при визначенні невідомого мікроба потрібно набір агглютинирующих сироваток різних видів. Запас сироваток завжди повинен бути в лабораторії. Такі сироватки готуються бактеріологічними інститутами. Сироватки випускаються в висушеному вигляді з відповідними позначками на етикетках (назва, титр, термін придатності).
Отримують імунні агглютинирующие сироватки за допомогою імунізації тварин (кролики, коні). Для імунізації вибирають типові в антигенному відношенні добре агглютинируют штами відповідного мікроба.
Для ідентифікації мікроорганізмів, що мають кілька серологічних типів, готують типоспецифічні (імонорецепторние) сироватки. Для цього з видових сироваток витягають групові антитіла, насичуючи їх послідовно родинними мікробами, які адсорбують неспецифічні аглютиніни. При роботі з такими сироватками можна обмежитися тільки реакцією аглютинації на предметному склі, не вдаючись до розгорнутої, лінійної аглютинації в пробірках.
Техніка постановки розгорнутої реакції аглютинації при визначенні виду мікроба полягає в наступному. У штатив встановлюють 10 пробірок (табл. 1), 9-а пробірка служить контролем сироватки, 10-я - контролем антигену. Для реакції необхідні такі інгредієнти: 1) агглютинируют діагностична сиворотка- 2) фізіологічний розчин кухонної солі-3) антиген - мікроб, виділений з матеріалу хворої людини (кров, кал, сеча і т. Д.).
Добову або 20-годинну досліджувану культуру на скошеному агарі змивають 5 мл стерильного фізіологічного розчину і отриману суспензію мікробів переносять в чисту пробірку. Реакція ставиться в обсязі 1 мл.

                    
Таблиця 1
Схема постановки розгорнутої реакції аглютинації з метою визначення виду мікроба (титр агглютинируют
сироватки 1: 12, 800)
пробірка

Готується ряд розведень сироватки. Як видно зі схеми, фізіологічний розчин наливають в усі пробірки, крім 1-й і 9-й, сироватку, розведену 1: 100 (0,1 мл сироватки + 9,9 мл фізіологічного, розчину), наливають тільки в 1-ю, 2-ю і 9-ю пробірки.
Вміст другої пробірки добре змішують і 1 мл переносять в 3-ю пробірку, з 3-й 1 мл переносять в 4-ю і т. Д., А з 8-ї 1 мл видаляють.
Таким чином отримують різні розведення сироватки від 1: 100 до 1: 12800. В кожну пробірку, за винятком 9-ї контрольної, вносять по 1-2 краплі мікробної суспензії.
Пробірки добре струшують і ставлять на 2 години в термостат, після чого виробляють попередній облік. Потім пробірки залишають ще на 18-20 годин при кімнатній температурі для остаточного обліку. Інтенсивність реакції позначається знаком (+), як і при постановці реакції аглютинації з сироваткою хворого.
Агглютинацию можна вважати специфічною тільки в тому випадку, якщо контроль абсолютно бездоганний, т. Е. Якщо за відсутності відповідної сироватки склеювання мікробів не відбувається. Контроль сироватки ставлять для виключення можливості утворення пластівців з самої сироватки. При оцінці результатів аглютинації велике значення має ступінь розведення сироватки, яка ще дає позитивний результат, а також швидкість реакції,, т. е. час, що минув від початку досліду до появи пластівців. Належність мікроба до того чи іншого виду можна вважати в тому випадку, якщо він аглютинується специфічною сироваткою, розведеною до титру або до половини титру.
Орієнтовна реакція аглютинації. При бактеріологічної діагностики черевного тифу, дизентерії, холери та інших захворювань вдаються до постановки орієнтовною аглютинації. Для цього на предметне скло наносять пастерівської піпеткою краплю агглютинируют сироватки в розведенні 1: 10 або 1: 20 і поруч - краплю фізіологічного розчину для контролю. Потім до кожної краплі петлею додають невелику кількість культури мікроба і ретельно розмішують до отримання гомогенної суспензії бактерій. Через кілька хвилин у краплі з сироваткою з`явиться помітне скучіваніе бактерій, що прискорюється при погойдуванні скла. Контрольна крапля залишається рівномірно каламутною (рис. 56).

Мал. 56. Агглютинация на склі.
Орієнтовною агглютинацией користуються для визначення виду мікроба при виділенні чистої культури на середовищах в чашках Гейденрейха-Петрі. Для аглютинації використовується колонія, з якої зроблений пересівши на косою агар, для постановки на наступний день розгорнутої (лінійної) аглютинації. Таким чином, орієнтовною агглютинацией можна прискорити постановку діагнозу, який потім підтверджується макроскопічної агглютинацией в пробірках,