Бруцели - мікробіологія з технікою мікробіологічних досліджень
Мал. 94. Бруцели в чистій культурі.
Забарвлення бруцелл по Козловському. Фіксований препарат забарвлюється при підігріванні 2% водним сафроніном (до появи пухирців), охолоджується, промивається водою і дофарбовував 0,75-1% водним розчином малахітової зелені протягом 17а-2 хвилин-бруцели зберігають червоний колір сафроніна, а решта бактерії і клітинні елементи фарбуються в зелений колір.
Культуральні та біохімічні властивості. Бруцели добре ростуть на звичайних поживних середовищах в аеробних умовах. Однак у збудника аборту корів- »Br. abq ^ tus bovis виражені мікроаерофільні властивості: перші генерації цього мікроба розмножуються виключно в атмосфері, що містить 5-10% вуглекислоти, і тільки наступні пересівання дають хороший зростання в звичайних умовах.
На чашках з агаром виростають дрібні, як крапельки роси, круглі опуклі колонії, поступово збільшуються до 2-3 мм в діаметрі. Ці колонії мають зазвичай гладке будова (S-форма), каламутна, з білуватим перламутровим блиском. В процесі дисоціації з`являються шорсткі форми (R-форми), які відрізняються від S-форми рядом ознак (табл. 22). На скошеному агарі виростають дрібні ізольовані колонії, які в подальшому зливаються, утворюючи сірувато-білий напівпрозорий наліт. Вирощування на агарі з 5% гліцерину або печінкової середовищі покращує ріст бруцел.
бруцели
Основниепрізнакі | S-форми | R-форми |
ростной агарі | Ніжний, вологий | Болеегрубий і сухий |
Відколоній | Круглі, опуклі, правильно контуровані, гомогенні або нежнозерністие | Круглі, менш опуклі, іноді неправильно контуровані, грубозернисті сзеленоватим металевим відтінком |
ростной бульйоні | Гомогенний, без просвітлення | Бавовняно, з осадом і проясненням |
Взвесьв фізіологічному розчині | Суспензіягомогенная, стійка | Суспензіянеравномерная, нестійка |
Термопреціпітаціясуспензіі при 90 ° | негативна | позитивна |
агглютіногеном | Дуже хороша | погана |
вірулентність | висока | Якправило, відсутня |
У бульйоні бруцели дають загальне помутніння з подальшим утворенням слизового осаду на дні, желатин НЕ розріджують, молока не згортають, вуглеводів розкладають. Ферментують білки з утворенням аміаку і сірководню, відновлюють нітрати в нітрити.
Антигенна структура. Бруцели володіють двома загальними соматичними антигенами А і М, так що провести різку грань між ними за допомогою реакції аглютинації не вдається. Залежно від типу бруцелл обидва антигени знаходяться всередині клітини в різних співвідношеннях. Так, у ВГ. melitensis переважає антиген М, а у Br. abortus bovis і Br. abortus suis- антиген А. Останнім часом у бруцелл виявлений Vi- антиген.
Резистентність. При впливі температури 60 ° бруцели гинуть протягом години. 1% розчин карболової кислоти вбиває їх протягом 15 хвилин. У висохлої сечі вони можуть зберігатися до 22 днів.
Патогенність для тварин і токсінообразованіе. До бруцел сприйнятливі морські свинки, білі миші, щури та кролики. У природних умовах бруцельоз зустрічається у кіз, овець, свиней і корів.
Екзотоксину бруцели не утворюють. Отруйна речовина мікробних клітин відноситься до ендотоксинів.
Патогенез і клініка. Джерелом інфекції при бруцельозі є великий і особливо дрібна рогата худоба (кози, вівці) і свині. Зараження людини відбувається в результаті безпосереднього контакту з заразним матеріалом (найчастіше при догляді за худобою) або в результаті вживання в їжу молока, молочних продуктів і м`яса від заражених тварин, якщо ці продукти не піддавалися тепловій кулінарній обробці.
Відомі численні випадки зараження через свіжий овечий сир - бринзу.
Вхідними воротами інфекції є шлунково-кишковий тракт, шкірні та слизові покриви. На місці вхідних воріт бруцели не викликають ніяких запальних явищ і проникають в регіонарні лімфатичні вузли, які вражають. У цих вузлах бруцелли інтенсивно розмножуються, а потім в результаті «прориву» регіонарного лімфатичного бар`єру, гематогенним шляхом поширюються по всьому організму, викликаючи первинну генерализацию інфекції. Струмом крові бруцели заносяться у внутрішні opгaни (селезінку, лімфатичні вузли, кістковий мозок і ін.), Де утворюються метастатичні вогнища. В останніх при загостренні процесу знову відбувається розмноження бруцел, які, потрапивши в кров, зумовлюють рецидиви генералізації інфекції. Інкубаційний період триває від 7 до 21 дня. Захворювання розвивається поступово. Типовим проявом інфекції служить ундулирующая лихоманка: температурна крива носить хвилеподібний (ундулирующий) характер. Бруцельоз протікає як хронічно рецидивуюча інфекція з досить різноманітною клінічною картиною (ураження нервів, суглобів, кісток, легенів, очей, печінки, селезінки та інших органів). У вагітних може наступити аборт. Зустрічаються атипові, легкі форми бруцельозу, що дають тільки невелике підвищення температури.
Хвороба може тривати від кількох місяців до кількох років і закінчується самовилікування - одужанням (П. Ф. Здродовский).
З організму хворих бруцели виділяються з сечею, а у жінок, що годують також з молоком.
Імунітет. Перенесене захворювання залишає попі себе відносний імунітет. У крові хворих виявляються аглютиніни, преціпітіни і комплечент-зв`язуючі антитіла. Вже на початку захворювання, в гострій його стадії починається імунологічна перебудова організму, в результаті чого гострий процес переходить у хронічний, потім в латентний стан і нарешті наступає самолікування.
У иммуногенезе при бруцельозі грають роль не тільки гуморальніфактори, але, як показали експерименти П. А. Вершилова на тварин, підвищення бар`єрної функції лімфатичних вузлів. Встановлено також, що при бруцельозі має місце посилення фагоцитозу, яке виявляється постановкою опсоно-фагоцитарної реакції.
Перебіг бруцельозу у людини і тварин супроводжується алергічною перебудовою організму, яка виражається в підвищенні чутливості інфікованого організму до бруцел і їх токсинів Виходячи з цього, для діагностики бруцельозу застосовується алергічна проба Бюрне.
Лабораторна діагностика. Бруцельоз відноситься до особливо небезпечних інфекцій і тому бактеріологічна діагностика може проводитися лише в спеціальних установах.
Матеріалом для лабораторного дослідження можуть бути кров, пунктат кісткового мозку грудини, сеча, молоко (для виявлення збудника) і сироватка хворого (для виявлення антитіл).
Метод гемокультури дозволяє виділити бруцели з перших днів захворювання. Кров, отриману венепункцію, засівають по 10 мл в дві колби з 100-200 мл м`ясо-пептонного або печінкового бульйону. Кращі результати виходять при додаванні до бульйону 1% глюкози і 2% гліцерину.
Для зростання Br. abortus bovis необхідно створити підвищену концентрацію вуглекислоти. Останнє досягається простим прийомом. Ватяну пробку, що закриває колбу, запалюють і заштовхують в глибину горлечка, яке потім щільно закривають зверху гумовою пробкою.
Засіяні колби (одна зі звичайним бульйоном, а інша з підвищеною концентрацією вуглекислоти) поміщають в термостат при 37 °, через 7-8 днів або трохи пізніше настає зростання бруцел, нерідко у вигляді дрібних колоній, вкраплених в тяжах фібрину. Бульйон при цьому або злегка мутніє, або залишається прозорим. При наявності росту на бульйоні проводиться висів на чашку з печінковим агаром і агаром Д. Сухий поживний агар Д підвищує висеваемость бруцелл і складається з живильного бульйону, дріжджового автолизата і хлористого натрію. Так як бруцели в перших генераціях мають уповільненим ростом, посіви слід витримувати в термостаті не менше місяця і кожні 5-7 днів робити висів на чашку з печінковим агаром. З вирослих колоній отвівают чисті культури, ідентифікація яких завершується реакцією аглютинації з бруцельозній імунною сироваткою. При диференціації типів бруцел враховують ставлення
Таблиця 23
Умови виращіваніяв перших генераціях | Бактеріостатіческоедействіе фарб | виділення сірководню | |||
Культура | фуксин 1:25 000 | тіонін 1:25 000 | піронін 1: 200 000 | ||
Brucellamelitensis | аероб | + | + | + | |
Brucella suis. | те ж | - | + | - | + |
Brucella abortusbovis | При 5-10% С02 | + | + | + АБО- | |
Умовні позначення: + наявність зростання або виділення сероводорода- - відсутність виділення зростання або відсутність виділення сірководню.
першої генерації культури до вуглекислого газу, здатність їх виробляти сірководень на печеночном агарі і зростання на щільних середовищах, до яких додані деякі анілінові фарби в певних концентраціях (табл. 23).
Для виділення міелокультури пунктат кісткового мозку, взятий шприцом з грудини, досліджують так само як кров на гемокультуру. Міелокультура виділяється в 1 / 2-2 рази частіше, ніж гемокультура. Для отримання урінокультури сечу беруть асептически катетером, центрифугують. Осад засівають на чашки з агаром, до якого додають генціанвіолет в розведенні 1: 200 000 для пригнічення росту грамположительной флори.
Найбільшу висеваемость бруцелл вдається отримати при посівах досліджуваного матеріалу в жовток свіжого курячого яйця або в жовтковий мішок курячого ембріона. Кров розводять 1: 3 цитратним бульйоном і в кількості 0,1-0,2 мл вводять в кілька яєць. (Техніка зараження яєць описана в розділі «Віруси» стор. 385.) Заражені яйця ставлять в термостат на 5 днів при 37 °, а потім 0,3 або 0,5 мл вмісту яєць засівають на щільні і рідкі поживні середовища, посіви досліджують кожні 2-3, дня.
Велике діагностичне значення має серологічна діагностика - реакція аглютинації Райта.
Реакція Райта. Ця реакція специфічна. Вона проявляється вже в перші дні захворювання і може довгий час зберігатися по зникнення симптомів бруцельозу.
Реакцію Райта ставлять при бруцельозі за методикою реакції Відаля. В якості антигену для реакції вживають вбиту суспензія бруцел, що містить 1 млрд. Бактерійних тел в 1 мл, для цього диагностикум, що містить 10 млрд. Мікробних тіл, розводять перед вживанням 1:10. Реакцію Райта ставлять завжди з двома контролями.
- Контроль сироватки ставлять з кожної випробуваної сироваткою.
- Контроль антигена ставлять в одній пробірці при будь-якому числі досліджуваних сироваток.
Пробірки ставлять на 4 години на термостат при 37 °, після чого виробляють перший облік- вдруге облік виробляють після 18-20 годин стояння при кімнатній температурі. Позитивна реакція при титрі 1: 50 вважається сумнівною, при титрі 1: 100 - слабо позитивної, при титрі 1 200 і 1 400 - позитивної і при титрі 1 800 і вище - різко позитивною.
Реакція Хеддльсона а-Кайтмазовой. Прискорений метод серодиагностики запропонував в 1926 р Хеддльсона. Модифікація Хеддльсона не мала широкого застосування до тих пір, поки Е. І. Кайтмазова не вдосконалювати і не раціоналізувала її. Для постановки реакції Хеддльсона-Кайтмазовой потрібні такі інгредієнти: 1) сироватка хворого, 2) фізіологічний розчин, 3) диагностикум (кольоровий). Суть цієї простої і високочутливої реакції аглютинації полягає в наступному (табл. 24).
Таблиця 24 Схема реакції Хеддльсона - Кайтмазовой
перший квадрат | другий квадрат | третій квадрат |
0,08 мл сироватки 0,03 мл антигену 0,01 мл сивороткі0,03 мл антигену | 0,04 мл сироватки 0,03 мл антигену 0,02 мл сивороткі0,03 мл фізіологічного розчину (контроль сироватки) П`ятий квадрат | 0,02 мл сироватки 0,03 мл антигену 0,03 мл антігена0,03 мл фізіологічного розчину (контроль антигену) Шостий квадрат |
Звичайне скло (розміром 20X15 см) розкреслюють на шість квадратів. У перші п`ять квадратів наносять мікропіпеткою сироватку хворого в кількості 0,08- 0,04 0,02- 0,01- 0,02 мл, в шостий - 0,03 мл діагностикумів. У перші чотири квадрата додають по 0,03 мл діагностикумів, в п`ятий і шостий - 0,03 мл фізіологічного розчину. Всі краплі обережно перемішують скляною паличкою у напрямку від більшого розведення до меншого, а потім скло злегка підігрівають над полум`ям пальника протягом 3 хвилин. У разі позитивної реакції з`являються виразні пластівці (аглютинація). Тривалість спостереження від 5 до 8 хвилин. Для діагностики бруцельозу застосовують також реакцію зв`язування комплементу, ставлять опсодо-фагоцитарну пробу.
Алергічна проба Бюрне. З метою діагностики, починаючи з 8-10-го дня захворювання, застосовують внутрішньошкірну алергічну пробу з Бюрне. В якості антигену використовують бруцеллін (або Мелітіну) - стерильний фільтрат з 3-4-тижневих бульйонних культур бруцел. При позитивній реакції через добу на місці введення бруцеліну (його вводять 0,1 мл внутрішньошкірно в середню частину згинальних поверхнях передпліччя) з`являється почервоніння і болісний набряк розміром 4-6 см (рис. 95 на вклейці).
Мал. 95. Алергічна проба Бюрне (позитивна).
Серед специфічних методів лікування бруцельозу вакцинотерапію убитої бруцельозній вакциною практично займає провідне місце. З інших засобів застосовують сульфаніламідні препарати (норсульфазол, сульфатиазол, стрептоцид) і антибіотики (стрептоміцин, біоміцин, синтоміцин і левоміцетин).
