Лептоспіри - мікробіологія з технікою мікробіологічних досліджень

Лептоспіри є збудниками гострих інфекційних захворювань - лептоспірозів, які вражають людину, гризунів, велику рогату худобу, овець, свиней, собак та інших тварин.
Вперше патогенні лептоспіри були виявлені в 1914 р японськими дослідниками Инада і Ідо, які виділили їх з органів морської свинки, зараженою кров`ю хворого інфекційної жовтяницею. Ці спірохети були названі ними Spirochaeta icterohaemorrhagiae.
У 1928 р С. А. Тарасовим виділено збудник водної лихоманки Leptospira grippotyphosa. Таку назву лептоспір було дано через деякого подібності клінічної картини водної лихоманки з грипом, а почасти з тифозним захворюванням.
Розрізняють дві форми лептоспірозу: інфекційну жовтяницю, або хвороба Васильєва-Вейля (жовтяничний лептоспіроз - збудник L. icterohaemorrhagiae), і безжовтушні лептоспіроз (водна лихоманка, післяжнивних, далекосхідна лихоманка і ін.), Які викликаються різними лептоспірозом L. grippotyphosa, L. batavia , L. canicola, L. DBA і ін.
Морфологія і тинкторіальних властивості. За морфологічними і культуральними властивостями все лептоспіри подібні між собою. Лептоспіри характеризуються надзвичайно дрібними численними завитками. У довжину лептоспіри мають 6-9 мк, а в товщину 0,25 мк. У центрі вони дещо товщі і витягуються у напрямку до кінців. Останні закінчуються пуговчатого стовщеннями (рис. 108). Лептоспіри мають активної рухливістю. Вони містять у своєму тілі дуже мало нуклеопротеидов і тому важко фарбуються (за Романовським в рожевий колір, при серебреніі- в коричневий або чорний). До того ж ці методи забарвлення настільки змінюють структуру лептоспір, що розпізнавання їх стає вкрай скрутним. Тому для їх виявлення застосовують метод дослідження в темпом поле зору (в живому стані).
Культивування. Культуру лептоспір легко отримати на середовищах, що містять мінімальну кількість білка.

Мал. 108. Лептоспіри інфекційної жовтяниці (чиста культура).

Для культивування лептоспір застосовують такі поживні середовища:

1. Розчин пептона у водопровідній воді (1: 1000) з додаванням кількох крапель метафосфорной кислоти.
2. Середа Уленгута, що складається із стерильного водопровідної води з 10% сироватки кролика, прогрітій при температурі 56-58 ° протягом 30 хвилин.
3. Фосфатно-сироваткове середовище терських - суміш 10 мл Vi5 М розчину Na2HP04 і Vis М розчину КН2Р04 з 90 мл дистильованої води: суміш стерилізують і додають 10% прогрітій сироватки кролика.

Після посіву середу покривається шаром рідкого парафіну або вазелінового масла. Перші дні посів рекомендується витримувати при температурі 32 °, наступні дні - при 25-28 °. Зростання лептоспір починається на 5-й день або пізніше. Лептоспіри не викликають помутніння бульйону. Наявність лептоспір визначається мікроскопічним дослідженням в темному полі зору.
Резистентність. Нагрівання в воді вбиває спирохет протягом 30 хвилин при 50-55 °.

Безжовтяничну лептоспіроз - водна лихоманка протікає більш доброякісно, без явищ жовтухи і крововиливів. На 4-7-й день хвороби в області ключиць іноді з`являється поліморфний висип, яка поступово поширюється на тулуб і кінцівки. Через 2-3 дні висип безслідно зникає. Температура тримається близько тижня. Звичайний результат хвороби - одужання.
Імунітет. Повторні захворювання спостерігаються рідко. У крові хворих виявляють лептоспіролізіни і аглютиніни.
Лабораторна діагностика. Матеріалом для лабораторного дослідження служить кров хворого в перші дні хвороби при наявності підвищеної температури, сеча з 10-12-го дня, при менінгеальних явищах спинномозкова рідина, за епідеміологічними показниками вода, харчові продукти, трупний матеріал (органи загиблих від лептоспірозу людей і тварин) .
Застосовують: 1) мікроскопічний метод дослідження, 2) посів матеріалу на живильне середовище, 3) серологічні методи дослідження і 4) біологічну пробу.
Для мікроскопічного дослідження крові її набирають (2-3 мл) з вени в шприц з 4 мл 1,5% розчину лімоннокіслого натрію. Суміш виливають в пробірку, центрифугують, відокремлюють осад. Сечу і спинномозкову рідину можна досліджувати без будь-якої обробки або після центрифугування протягом декількох годин при 4000 об / хв. Після центрифугування рідина виливають, а осад досліджують. Краплю досліджуваного матеріалу наносять на тонкі предметні скельця (не товще 1 мм) і накривають покривним склом (не товще 0,2 мм). Отриманий препарат «роздавленою» краплі розглядають в темному полі. У препараті буде видно тонкі сріблясто-білі рухливі лептоспіри.

Так як мікроскопічне дослідження дає невеликий відсоток позитивних результатів, необхідно виділити чисту культуру лептоспір. Кров хворого, узяту з вени (5 мл), засівають в 3 пробірки (2 мл, 1 і 0,2 мл) з бессивороточной середовищем. У самій крові міститься достатня кількість поживних речовин для росту лептоспір. Сечу і спинномозкову рідину засівають по 0,5-1 мл в 3-4 пробірки середовища, що містить сироватку кролика. Від трупа людини або тварини беруть невеликі шматочки нирок, селезінки, печінки, мозку, розтирають у фарфоровій ступці з 2-3 мл фізіологічного розчину. Все це проробляють стерильно. Отриману суспензію зливають в пробірки, відстоюють 1 годину. Верхній шар відстояної рідини микроскопируют, а потім засівають по 1 мл на 3-4 пробірки живильного середовища. Посіви ставлять в термостат і кожні 5 днів (протягом 3 місяців) з них готують препарати для мікроскопії в темному полі.
При посіві забрудненого матеріалу (осаду сечі, води і т. Д.) Поряд з розмноженням лептоспір спостерігається зростання сторонньої мікрофлори. У цих випадках для отримання чистої культури лептоспір 3-4 мл досліджуваного матеріалу вводять внутрішньочеревно морській свинці. Через 10-15 хвилин у неї беруть кров із серця і засівають на бессивороточной живильне середовище.
При посіві крові хворого в 80% випадків спостерігається позитивний результат.
Серологічна діагностика лептоспірозів заснована на виявленні агглютінінов, лізину і комплементсвязивающіх антитіл в сироватці хворих (з 2-го тижня захворювання). Реакція аглютинації - лізису ставиться таким чином. Досліджувану сироватку розводять від 1: 50 до 1: 10 000 і розливають по 0,2 мл (чотири краплі) в невеликі агглютінаціонние пробірки, поставлені в кілька рядів (по числу серологічних типів лептоспір, з якими ставиться реакція). У всі пробірки кожного ряду додають рівну кількість живої культури, лептоспір певного типу L. ictefohaemorrhagiae, L. Kazan., L. Weil- L. canicola, L. batavia, L. grippotyphosa, L. DBA, L. kasachstanica I і ін.
У контрольні пробірки замість сироватки наливають 0,2 мл фізіологічного розчину і 0,2 мл культури лептоспір. Пробірки струшують і ставлять на 2 години в термостат при температурі 25-30 °. З кожної пробірки готують препарат «роздавленою» краплі і микроскопируют в темпом поле.

Мал. 109. Реакція аглютинації і лізису лептоспір.
1 - контроль-2 - аглютинація лептоспір- 3 - початок лізису - зернистий
розпад.
При наявності в сироватці антитіл в перших розведеннях спостерігається лізис: повне розчинення лептоспір, частковий лізис або зернисте набухання. У подальших розведеннях виявляють агглютінацію- скупчення лептоспір у вигляді «павучків» (рис. 109). Діагностичне значення має позитивна реакція в розведенні сироватки 1: 400.
При постановці реакції зв`язування комплементу сироватку хворих розводять 1: 10, 1: 100. Антигеном служить культура лептоспір або їх аутолізат.
Для біологічної проби 3 мл крові хворого в гарячковому періоді, 5-10 мл сечі або спинномозкової рідини, 1 мл суспензії органів з трупа людини або тварини вводять морській свинці внутрибрюшинно. Картина захворювання і результати розтину загиблої морської свинки описані вище.
Лікування і профілактика. Лікування лептоспйрозов проводиться пеніциліном. Рекомендується застосування сироватки імунізованих лептоспірозом коні або сироватки видужуючих.
До профілактичних заходів загального характеру відноситься: оздоровлення місцевостей, ендемічних по інфекційної жовтяниці, збільшення кислотності грунту і дератизація. Специфічна профілактика полягає в застосуванні вакцини, що включає в себе убиті нагріванням лептоспіри 3 типів (іктерогеморрагія, грип-тіфозі і Монакова).