Спірохета сифілісу - мікробіологія з технікою мікробіологічних досліджень
патогенних спірохет
Спірохети на відміну від бактерій складають менш поширену групу мікроорганізмів.
Все спірохети не утворюють спор і капсул. За Грамом не прикрашає (грамнегативні). Важко культивуються на живильних середовищах. Спірохети - сапрофіти зустрічаються у водоймах, багатих органічними відходами, в мулі, в порожнині рота і кишечнику людини. За своїми морфологічними ознаками патогенні спірохети поділяються на три групи.
- Treponema, що мають форму правильної спіралі. Так само як спирохета сифілісу.
- Borrelia, що мають форму звивистих нитки з вигинами і ширшими завитками. До цієї групи належать спірохети поворотного тифу і спірохета Венсана.
- Leptospira, мають численні дрібні завитки і характерні закінчення у вигляді гачків (лептоспіра інфекційної жовтяниці).
спірохети сифілісу
Збудником сифілісу є бліда спірохета Spirochaeta pallida, описана вперше Ф. Шаудином і Е. Гофманом в 1905 р За 2 роки до цього, експериментуючи на мавпах, спірохету сифілісу виявив Д. К. Заболотний.
Морфологія і тинкторіальних властивості. Бліда спірохета являє собою дуже ніжну, тонку, слабо заломлення світло нитка з дрібними, рівномірними, правильними вигинами (рис. 104 і 105 на вклейці).
Мал. 104. Treponema pallidum в темному полі.
В середньому вона має від 6 до 14 мк у довжину і 0,25 мк в товщину. Найменування блідою вона отримала в зв`язку з поганою окрашиваемости аніліновими фарбами і слабкою видимістю в живому стані. Ці властивості обумовлені малим вмістом нуклеопротеидов і багатством липоидов в тілі спірохети. Щоб її пофарбувати, застосовують метод Романовського (рис. 105) або ж фарбують, піддавши попередньо дії якоїсь протрави. Найкращим методом виявлення блідої спірохети є дослідження в темному полі зору. У свіжому матеріалі при дослідженні в мікроскоп з затемненим полем зору бліда спірохета проявляє активні рухи навколо поздовжньої осі, а також поступальні і обертальні рухи.
Культивування. На звичайних поживних середовищах спирохета сифілісу не розмножується. В. М. Арістовскій і А. А. Гельцер з успіхом застосували рідку живильне середовище, що складається з кролячої сироватки, з додаванням до неї шматочка мозкової тканини. Поверхня середовища після посіву заливають вазеліном. У культурах спірохети грубіші, короткі і відрізняються поліморфізмом. Отримані культури позбавлені патогенних властивостей і називаються «культуральним» на відміну від «тканинних», які зберігають патогенні
властивості і підтримуються в лабораторіях шляхом пасажів на кроликах.
Резистентність. Бліда спірохета мало стійка до висушування і високій температурі. Нагрівання до 45-48 ° вбиває її протягом години, до 55 ° -за 15 хвилин. До низьких температур менш чутлива. При 10 ° вона зберігає життєздатність до декількох діб. Дезинфікуючі речовини надають згубну дію. З хімічних речовин найбільш сильну дію надає 1-2% розчин фенолу.
Патогенність для тварин. І. І. Мечникову і Д. К. Заболотного вперше вдалося отримати експериментальний сифіліс у людиноподібних мавп. Кроликів можна заразити, вводячи їм патологічний матеріал в рогівку, передню камеру очі, в шкіру, слизову оболонку і т. Д. У тварин при цьому розвивається первинне ураження у вигляді типового склерозу (твердий шанкр) на місці щеплення.
Патогенез і клініка сифілісу. Єдиним джерелом інфекції є людина, хвора на сифіліс. Захворювання може передаватися як прямим контактом (найчастіше статевим), так і через предмети, забруднені сифилитическими виділеннями. Їжа з загального посуду, користування загальною ложкою і т. П. (Непрямий контакт) можуть сприяти поширенню побутового сифілісу.
Бліда спірохета проникає в організм через пошкоджену слизову і шкіру. Через 3-4 тижні на місці вхідних воріт з`являється первинний склероз-твердийшанкр (виразка, що має щільні краю і дно-звідси назва твердийшанкр), який характеризує первинний період сифілісу.
Надалі мікроб проникає в організм по лімфатичних і кровоносних шляхах і поширюється по всьому організму - настає другий період. Цей період характеризується ураженням шкіри і слизових оболонок, на яких з`являються розеоли, папули, везикули і пустули - сіфіліди. Другий період триває від 2-3 місяців до кількох років. Якщо сифіліс лікували недостатньо, наступає третій період - гумозний. Гуми (гранульоми) представляють собою клітинні скупчення, що складаються з лімфоцитів, епітеліоїдних і плазматичних клітин. Вони можуть бути в товщі шкіри, слизових оболонках, внутрішніх
органах і т. д. Гумми іноді досягають великих розмірів, дрібні судини біля них поступово зменшуються в просвіті і в кінці кінців закриваються. У зв`язку з цим живлення клітин гуми порушується і настає глибоке їх руйнування з утворенням виразок і рубців в будь-яких тканинах і органах.
У деяких випадках сифіліс переходить в четвертий період, який характеризується ураженням центральної нервової системи у формі прогресивного паралічу і спинний сухотки. Клінічні прояви сифілісу відрізняються тим, що в більшості випадків з`являються ураження шкіри і слизових безболісні, зникають навіть без лікувального втручання, рецидивують і на закінчення дають важкі ураження третього і четвертого періоду.
Імунітет. Вродженого імунітету до сифілісу у людини не спостерігається. Перенесене захворювання також не залишає того виду набутого імунітету, яким характеризується більшість ііфекціонних хвороб. При вторинному зараженні хворого сифілісом спірохети не гинуть, а зберігаються і поширюються по організму, інфікуючи органи і тканини поряд зі збереженими спірохетами первинного зараження. Однак при вторинному зараженні сифілісом відсутня первинна форма реакції - шанкр. Це імунологічний стан називається «шанкерним імунітетом».
Під «імунітетом» при сифілісі розуміють імунологічну перебудову організму, в зв`язку з чим змінюється характер патологічних змін і сама клінічна картина. Що стосується механізму цього «імунітету», то він не обумовлений гуморальними факторами, хоча в сироватці хворих виявляють антитіла (лізину, аглютиніни).
Лабораторна діагностика. У першому періоді сифілісу діагноз ставиться за допомогою бактеріоскопічного дослідження в темному полі або в забарвлених мазках матеріалу з твердого шанкра.
Для дослідження необхідно витягти тканинну рідину з глибоких частин місця ураження, що містять більшу кількість спірохет. З цією метою спочатку ретельно протирають поверхню шанкра стерильним тампоном, змоченим в фізіологічному розчині, потім легким стисканням дна виразки видавлюють з неї невелику кількість тканинної рідини. Якщо це не вдається, дно виразки дратують, злегка поскаблівая скальпелем або гострою ложечкою. Отриману рідину відсмоктують пастерівської піпеткою.
Краплю рідини найкраще досліджувати в темному полі, де чітко видно морфологія яскраво освітлених спирохет і їх характерні руху.
Зустрічаються на статевих органах і в порожнині рота сапрофітіческій спірохети (на статевих органах-Sp. Refringens, в порожнині рота - Sp. Microdentium) відрізняються від блідої спірохети по своїй морфології і характеру руху. Sp. refringens має більш грубе тіло з великими завитками, не володіє поступальним рухом, Sp. microdentium відрізняється від блідої спірохети характером свого руху.
Можна також приготувати мазки з тушшю по Буррі (див. Стор. 51), де на чорному тлі добре видно форма сірувато-білих спирохет і їх завитки.
Для дослідження пофарбованого препарату готують тонкі мазки: помістивши краплю рідини на предметне скло, розподіляють її по поверхні краєм другого скла (так само, як готують мазок з краплі крові). Мазки висушують на повітрі, фіксують в метиловий спирт і забарвлюють протягом 12-15 годин за Романовським (стор. 52): бліда спірохета забарвлюється в рожевий колір, що дозволяє відрізняти її від інших сапрофітіческій спирохет, забарвлюються в блакитний колір (див. Рис. 105).
Мал. 105. Бліда спірохета у виділеннях з твердогошанкра. Забарвлення за Романовським.
У другому періоді сифілісу, коли на шкірі і слизових оболонках з`являються сіфіліди, також беруть з уражених ділянок тканинний сік і досліджують його на наявність спірохет.
Через 4-5 тижнів від початку зараження можна проводити серологічне дослідження, яке є найпоширенішим методом діагностики сифілісу.
Серодиагностика сифілісу заснована на постановці реакції Вассермана і осадових реакцій.
Реакція Вассермана. Техніка реакції Вассермана не відрізняється від техніки реакції зв`язування комплементу. Істотною відмінністю є спосіб приготування антигенів, а також їх титрування.
Як антигени для реакції Вассермана користуються ліпоїдному екстрактами з патологічних або нормальних тканин. Так звані специфічні антигени, приготовані з сифилитических органів, відрізняються більш високою активністю, завдяки чому титр їх зазвичай досягає тисячних часток мілілітра (титр 0,007, 0,05 на 1 мл і т. Д.). Неспецифічні антигени менш активні, тому титр їх нижче і знаходиться в межах сотих часток мілілітра (наприклад, титр 0,01, 0,02 на 1 мл).
При постановці реакції Вассермана застосовують 3 антигену (№ 1, 2 і 3 кардіоліпіновий). Антиген № 1-специфічний. Він містить ліпіди сифилитической спірохети, отримані шляхом екстрагування з тестикулярной ткапі зараженого сифілісом кролика. Антигени № 2 і 3 є неспецифічними і містять ліпіди нормальної тканини (спиртові екстракти м`язів бичачого серця з додатком 0,25-0,3%&rsquo- холестерину). Антиген кардіоліпіновий є очищеним препаратом, його треба розводити швидко, причому після розведення він повинен бути злегка опалесціюючий, але не каламутним. Титром антигену позначається то його кількість, яка повинна знаходитися в 1 мл фізіологічного розчину і яке не затримує гемоліз при наявності гемолітичної системи і комплементу.
Наприклад, якщо на ампулі вказано титр антигену 0,05 мл, то це означає, що при роботі слід розвести антиген фізіологічним розчином так, щоб в мл рідини знаходилося 0,05 мл антигену.
У зв`язку з тим що антигени можуть володіти різними антікомплементарние властивостями, перед постановкою реакції Вассермана комплемент титруються не тільки в чистому вигляді, але і в присутності антигенів. Так як реакція Вассермана ставиться з 3 антигенами, то слід титрувати комплемент з кожним антигеном окремо.
Модифікація реакції Вассермана- реакція Григор`єва-Рапопорт (табл. 25). Ця реакція заснована на використанні комплементарної активності досліджуваної сироватки. В реакції вживається (не пізніш 36 годин після отримання) активна (непрогріта) сироватка хворого. Для виконання реакції необхідні антигени, гемолітична сироватка і дефібринованої неотмитая, профільтрована через два шари марлі кров барана.
Схема реакції Григор`єва - Рапопорт
Інгредієнти (в мл) | 1-я | пробірки | 3-тя |
активна іспитуемаясиворотка | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
Фізіологічний розчин | 0,5 | 0,5 | 0,8 |
Антігенспеціфіческую, розведений за титром | 0,3 | - | |
Антігеннеспеціфіческій, розведений за титром | 0,3 | ||
Кімнатна температура 22 ° протягом 25 хвилин | |||
гемолітична система | 1 | 1 | 1 |
Кімнатна температура 22 ° протягом 25 хвилин. | |||
У випадках відсутності гемолізу в контролі сироватки реакцію проводять повторно, причому до 0,2 мл досліджуваної сироватки дабавляют 0,2 мл свідомо активної негативної сироватки, в зв`язку з чим відповідно зменшується обсяг додається фізіологічного розчину.
Результати досвіду враховують негайно після закінчення реакції на підставі показань двох перших пробірок, що містять антиген. Позитивний результат характеризується повною затримкою гемолізу, негативний - повним гемолізом. У контролі сироватки (3-тя пробірка без антигену) повинен мати місце повний гемоліз.
Крім зазначених реакцій, для серодиагностики сифілісу широко застосовують осадові реакції, сутність яких полягає у взаємодії інактивованої сироватки хворого з антигеном, внаслідок чого в пробірці випадає осад. З них реакції Кана і Закса-Вітебського мають найбільше застосування.
Реакція Кана. Для постановки реакції Кана необхідні такі інгредієнти: 1) інактивована сироватка крові хворої людини, 2) спеціальний антиген Кана і 3) фізіологічний розчин.
Антиген Кана є екстракт липоидов з м`язів баранячого серця, до якого долучено холестерин. Перед досвідом, в залежності від титру, вказаного на етикетці, антиген розводять наступним чином. В одну чисту і суху пробірку наливають антиген, а в іншу - фізіологічний розчин в кількості, зазначеній на етикетці (1 1,1- 1,2). Потім фізіологічний розчин з другої пробірки швидко виливають у першу, яка містить антиген (а не навпаки). Отриману суміш розмішують, переливаючи її з пробірки в пробірку 6-8 разів, і залишають на 10 хвилин при кімнатній температурі для дозрівання.
Постановка досвіду. У штатив встановлюють шість агглютінаціонние пробірок. Перші три пробірки (1-я, 2-а і 3-я) є досвідченими, наступні три (4-я, 5-я і 6-я) -Контрольний (контроль антигену). Розведений антиген після його дозрівання вносять мікропіпеткою в 3 досвідчені і 3 контрольний пробірки. Микропипетка з антигеном повинна бути опущена на дно сухої пробірки, не торкаючись її стенок- цим досягається точність відмірювання антигену. У 1-у пробірку наливають 0,5 мл, в 2-у - 0,025 і 3-ю - 0,0125 мл антігена- така ж кількість антигену розливають відповідно в 3 контрольні пробірки. У всі досвідчені пробірки доливають по 0,15 мл досліджуваної сироватки, в контрольние- таку ж кількість фізіологічного розчину. Штатив із пробірками протягом 3 хвилин енергійно струшують, щоб відбулося перемішування сироватки з антигеном, і ставлять в термостат при 37 ° на 10 хвилин. Вийнявши з термостата, додають в першу дослідну і першу контрольну пробірки по 1 мл фізіологічного розчину, в другу і третю досвідчені, контрольну пробірки по 0,5 мл фізіологічного розчину. Вміст пробірок знову струшують і враховують результати реакцій (схема реакції Кана представлена в табл. 26).
Примітка. При будь-якій кількості досліджуваних сироваток контроль антигену ставиться один. В позитивних випадках реакції ставиться контроль сироватки. З цією метою її наливають у пробірку в кількості 0,1 мл, додають 0,3 мл фізіологічного розчину і струшують протягом трьох хвилин.
Облік реакції проводять неозброєним оком, за допомогою лупи або агглютіноскопа.
Таблиця 26
Схема реакції Кана
При обліку реакції неозброєним оком кожну пробірку виймають з штатива і, злегка нахиливши, тримають трохи вище рівня очей перед джерелом світла. Випадання пластівців (преципитата) в пробірках з досліджуваної сироваткою служить показанням позитивної реакції Кана і позначається плюсами. Різко позитивна реакція позначається чотирма плюсами (+ + + +) - для неї характерно випадання ясно видимих пластівців у всіх пробірках і злегка опалесцирующей рідини. Позитивна реакція позначається трьома плюсами (+ + +) і характеризується менш чітко вираженим випаданням пластівців у всіх пробірках. Для слабо позитивної реакції, що позначається двома плюсами (+ +), характерно більш слабке утворення осаду і наявність дрібних частинок в мутнуватої рідини. Освіта дуже дрібних зважених частинок в мутнуватої рідини позначають одним плюсом (+). Відсутність осаду і вільно зважених часток в рідині є показником отри-цательной реакції і позначається мінусом (-). У контрольних пробірках не повинні спостерігатися пластівці.
Цитохолевая осадові реакції (табл. 27) Закса-Вітебського. Для цієї реакції потрібно мати інактивовану досліджувану сироватку і цитохолевая антиген Закса-Вітебського, є екстрактом липоидов з м`язів серця великої рогатої худоби, до якого долучено холестерин.
Таблиця 27
Схема цитохолевая реакції Закса - Вітебського
Інгредієнти (в мл) | досвід | контроль | контроль |
досліджувана сироватка | 0,1 | ; | 0,1 |
Розведений за титром антиген | 0,05 | 0,05 | - |
Етиловий спирт 96 ° 1: 2 | - | - | 0,06 |
Фізіологічний розчин | - | 0,1 |
Струшувати 1 хвилину і залишити при кімнатній температурі на 30 хвилин
Фізіологічний розчин I 0,5 I 0,5 I 0,5
При випаданні кристалів холестерину в антигене його слід прогріти на водяній бані при температурі 55-56 ° або ж в термостаті. На ампулі вказано титр антигену. Антиген розводять фізіологічним розчином згідно із зазначеним титру, 1 мл антигену піпеткою швидко додають до 2 мл фізіологічного розчину, добре розмішують цієї ж піпеткою і залишають на 10 хвилин при кімнатній температурі для дозрівання.
Досвід ставлять в трьох агглютінаціонние пробірках. В першу пробірку відмірюють 0,1 мл досліджуваної сиророткі і додають 0,05 мл розведеного антигену, в другу наливають 0,05 мл розведеного антигену і 0,1 мл фізіологічного розчину і в третю пробірку- 0,1 мл досліджуваної сироватки і 0,05 мл етилового спирту. Всі пробірки струшують протягом однієї хвилини і залишають на 30 хвилин при кімнатній температурі. Потім в кожну з них додають по 0,5 мл
фізіологічного розчину, знову струшують і враховують результати. Контроль антигена ставлять в одній пробірці для всього досвіду. Облік реакції Закса-Вітебського роблять так само, як реакції Кана.
Реакція іммобілізації блідих трепонем. В даний час для діагностики сифілісу застосовується також реакція іммобілізації трепонем, сутність якої! полягає в здатності сироватки крові хворого на сифіліс зупинити рух спірохет. Антигеном для цієї реакції служать живі трепонеми, отримані з тестикулярной тканини зараженого кролика. Антиген вважається придатним, якщо при мікроскопії виявляють велику кількість рухливих трепонем. За три тижні до постановки реакції хворий не повинен отримувати антибіотиків або інші протисифілітичні препарати. Ця реакція є більш специфічною і чутливої в порівнянні з реакціями Вассермана і осадовими.
Хіміотерапія. Для лікування сифілісу з успіхом застосовують препарати ртуті, вісмуту, миш`яку (сальварсан, новарсенол, міарсенол) і пеніцилін.
