Підготовка посуду, приготування фізіологічного розчину - мікробіологія з технікою мікробіологічних досліджень
ПІДГОТОВКА посуду, Приготування ватяні ПРОБОК ТА ФIЗIОЛОГIЧНОГО РОЗЧИНУ
Посуд. Скляний посуд (матраци, флакони, пробірки і т. Д.) Широко використовуються в мікробіологічній лабораторії як для вирощування мікробів на поживних середовищах, так і для інших цілей. Перед використанням посуд необхідно відповідним чином підготувати. З цією метою вживану посуд стерилізують, миють теплою водою з допомогою йоржа або щітки, після чого споліскують 2 3 рази дистильованою водою і сушать.
Якщо звичайного миття посуд піддається насилу, її обробляють протягом 30 хвилин хромової сумішшю (на 1 л води 50 г двухромовокислого калію, 100 г технічної сірчаної кислоти), після чого добре промивають водою.
Посуд зі слідами агару, желатину і інших поживних середовищ можна замочувати за добу перед миттям в розчині лугу. Для знебарвлення невідміна фарби вживають 3% розчин хлорного вапна.
Посуд, що застосовується для поживних середовищ, не можна обробляти дезінфікуючими речовинами. Домішка останніх робить сприятливе середовище непридатною.
Сушити посуд слід в сушильній шафі, або в кімнаті-сушарці з температурою до 50 ° і хорошою вентиляцією.
Ватні пробки. Сухі пробірки, колби, флакони, пляшки закривають ватяними пробками, які готують наступним чином. Кладуть на стіл довгасту чотирикутну платівку вати відповідної величини, загинають всередину всі чотири краю (рис. 25) так, щоб вийшла стрічка, по ширині дорівнює довжині пробки, і скачують валик по діаметру пробірки або колби. Ватяну пробку можна обгортати шматочком марлі в один шар. Кінці марлі пов`язують зовні над пробкою ниткою. В даний час випускаються спеціальні машини-верстати для виготовлення ватних пробок.
Фізіологічний розчин. На 1 л дистильованої води беруть 8,5 г кухонної солі, розчиняють при кип`ятінні, остуджують, фільтрують через паперовий фільтр і стерилізують в автоклаві при 120 ° протягом 20 хвилин.
Користування пипетками. У мікробіологічної лабораторії широко користуються піпетками. Піпетки бувають пастерівські і градуйовані. Перші не мають поділів, і розрахунок рідини при роботі з ними ведеться на краплі- другі мають поділу, і кількості витікання з них рідини визначається в мілілітрах, десятих частках мілілітри й т. Д. Один кінець піпетки широкий, інший - вузький. Для регулювання витікаючої рідини широкий кінець піпетки закривають вказівним пальцем і відкривають лише настільки, щоб витікання відбувалося повільно. Піпетки затикають ватою з того кінця, який беруть в рот. Грудочку вати не повинен бути дуже щільним, але і не повинен вільно рухатися в піпетці. Волокна вати не повинні стирчати з-за краю піпетки, так як вони не дадуть можливості щільно затиснути останню пальцем. Виступаючі шматочки вати можна спалити на полум`ї пальника. Піпетки по одній або декілька штук загортають в папір і стерилізують. При роботі з заразним матеріалом на верхній (широкий) кінець піпетки нерідко додатково надягають гумову трубку або грушу, через яку і виробляють насос.
Мал. 25. Скочування ватяною пробки.
Стерилізація І ЇЇ ВИДИ
Повне звільнення даного предмета, матеріалу, живильного середовища від усіх без винятку мікробів називається стерилізацією (знепліднювання). Поняття «стерилізація» ширше поняття «дезінфекція», так як під час останньої мають на увазі знищення тільки патогенних мікробів. Розрізняють такі види стерилізації: 1) стерилізація високою температурой- 2) механічна стерилізація.
- Стерилізація високою температурою здійснюється різними способами:
а) прожарювання на полум`ї пальника - найбільш швидкий і вірний спосіб стерилізації, але має обмежене застосування, так як більшість предметів від прожарювання псується. Прожарювання стерилізують платинові петлі, голки, шпателі і дрібні металеві та скляні предмети, наприклад пінцети, предметні скельця, піпетки і т. Д
б) кип`ятіння - найпростіший спосіб стерилізації. Кип`ятінням протягом 30 хвилин стерилізують шприци, хірургічні інструменти і т. П. Додаток до води 1% соди охороняє інструменти від ржавіння і в той же час підвищує надійність стерилізації. Однак цей спосіб не абсолютно надійний, так як спори деяких бактерій можуть зберігатися і при тривалому кіпяченіі-
в) стерилізація текучою парою проводиться в текучепаровом апараті Коха. Цей апарат (рис. 26) являє собою бляшаний циліндр з подвійними стінками, прикритий зверху конічної кришкою. Для зменшення тепловіддачі апарат зовні обшитий повстю або азбестом. У кришці є отвір, куди вставляють термометр. Усередині апарату є бляшане, вільно виймається відерце (для стерилізується матеріалу), стінки і дно якого забезпечені отворами.
На внутрішній стороні циліндра на різній висоті євиступи, на які кладуть продірявлені бляшані кола. На дно апарату наливають воду, ставлять в апарат предмети, що підлягають стерилізації, і підігрівають його, поки з верхнього отвору не піде сильний струмінь пара при цьому температура всередині апарату стане рівною 100 °. Нагрівання при 100 ° продовжують від 30 до 60 хвилин. Для більшої надійності, а також для стерилізації деяких матеріалів, які змінюють свої властивості при тривалій дії високої температури (желатину, цукор і деякі інші), таке нагрівання зазвичай виробляють 3 дні поспіль по 30-60 хвилин (дрібна стерилізація). Під час першого нагрівання вегетативні форми мікробів будуть вбиті, але можуть зберегтися спори. До наступного дня спори проростають і перетворюються у вегетативні форми, особливо якщо стерилізується предмет залишається протягом доби при температурі не нижче 20-22 °. Наступним нагріванням вбиваються ці знову з`явилися вегетативні форми. Так як можливо, що деяка частина спір не встигла прорости, матеріал витримують ще 24 години при кімнатній температурі, а потім проводять третю стерилізацію.
Мал. 26. Апарат Коха для стерилізації текучим паром.
Мал. 27. Автоклав вертикальний.
Отже, правило стерилізації в апараті Коха: 3 дні поспіль по 30-60 хвилин-
г) стерилізація парою під тиском проводиться в автоклаві (рис. 27 і 28), який побудований за принципом Папінова котла. Автоклав вперше введений в практику нашим співвітчизником Гейденрейх в 1884 р Він складається з масивного циліндричного мідного котла, оснащеного обшивкою з листового заліза. Котел закривається герметично металевою кришкою, щільно пригвинчується гвинтами. На кришці, а іноді в стінці автоклава (в залежності від конструкції) є кілька отворів: для манометра, запобіжного клапана і випускного крана для пара.
Всередині мідного котла завантажено інший котел так, що між ними залишається вільний простір. Між котлами наливають воду через лійку, вставлену в водомірну трубку. Водомірна трубка укріплена в стінці котла. Рівень води в автоклаві і водомірної трубці встановлюється на одній висоті за законом сполучених посудин. У верхнього краю котла міжстінний простір за допомогою ряду отворів повідомляється з внутрішнім котлом. Пара піднімається між стінками котлів через верхні отвори, проходить в стерилізаційне простір і через стерилізується матеріал, потім виходить через випускний кран.
Мал. 28. Автоклав горизонтальний.
Стерилізацію в автоклаві здійснюють наступним чином. В автоклав наливають воду. Предмети, що підлягають стерилізації (бікси, поживні середовища і т. Д.), Встановлюють всередині котла, загвинчують кришку, відкривають до відмови випускний кран і підігрівають воду. Коли вода нагріється, з крана починає виходити пар разом з повітрям. Необхідно, щоб все повітря була витіснена паром, так як в противному випадку показання манометра не відповідатимуть температурі. Коли температура всередині котла досягне 100 °, з крана почне бити струмінь пара. Коли пар витіснить все повітря з автоклава, він піде через паровий кран повної свистячої струменем, що не містить вологи (сухий пар). Тоді кран закривають. Пара, що утворюється не виходить назовні, а надходить в замкнутий простір і, накопичуючись в усе більшій кількості, підвищує тиск, а разом з тим і температуру, про що свідчать показання манометра і термометра. При тиску 2 атм. (З огляду на нормальний тиск) температура буде дорівнює 120 °, при Тиску 3 атм.-134 °. Коли тиск досягне потрібних свідчень (зазвичай 2 атм.) Починають регулювати нагрівання, утримуючи тиск на цій висоті протягом 20-30 хвилин, потім припиняють нагрівання і чекають, коли стрілка манометра впаде до нуля. Обережно випускають пару, відкривають кришку і виймають матеріал.
Мал. 30. Апарат для стерилізації гарячим повітрям.
Мал. 29. Піч Пастера.
Якщо стерилізують рідини, кран не слід відкривати раніше, ніж стрілка манометра дійде до нуля. В іншому випадку внаслідок швидкого падіння тиску рідина скипить, «викине» ватяні пробки і сама вихлюпнеться з судин. Для контролю дії автоклава користуються різними речовинами, що мають певну точку плавлення, наприклад бензонафтолом, - температура плавлення 110 °, антипірином -113 °, резорцином і сіркою - 119 ° і бензойної кислотою -120 °. При випробуванні в скляну трубочку довжиною 5 6 см, запаяну з одного кінця, насипають одне з перерахованих вище речовин, додають трохи сухої аніліновою фарби (фуксин, сафранін, брілліантгрюн і ін.) І трубочку запаюють. Трубочку з порошком поміщають в автоклав між стерилізується предметами. Якщо температура достатня, речовина розплавиться і яскраво забарвиться в колір, відповідний взятої краске-
д) стерилізація сухим жаром проводиться в печі Пастера (рис. 29), яка являє собою бляшаний шафа з подвійними стінками, що зовні є азбестом з електронагрівальних приладом. Нагріте повітря циркулює в просторі між подвійними стінками і виходить назовні через одне або через ряд спеціальних отворів. Гаряче повітря нагріває предмети, що знаходяться в шафі. Стерилізація сухим жаром має тривати 1 годину при 160 ° або 3/4 години при 165-170 °. Контроль за температурою проводиться за показаннями термометра. Початок стерилізації відраховується від того моменту, коли термометр показує 160-165 °.
У випускаються в даний час електричних апаратах, різноманітних за формою і забезпечених хорошою тепловою ізоляцією, необхідна температура підтримується автоматично, за допомогою терморегулятора, роботу якого спостерігають за контрольної лампочці (рис. 30).
Знепліднювання в пастерівської печі піддаються вся скляний посуд, пастерівські піпетки, папір і вата в маленьких пакетах. Підлягають стерилізації сухі пробірки і колби закривають ватяними пробками, щоб після стерилізації бактерії з повітря не потрапили всередину. Чашки Гейденрейха по одній або декілька загортають в бумагу- так само роблять з піпетками і воронкамі-
е) тиндалізація застосовується для знепліднювання речовин, змінюється під дією температури 100 °. Такі об`єкти піддаються прогріванню протягом 5 днів поспіль по 1 годині при температурі 56-58 °. Тиндалізація проводиться або на водяній бані або в спеціальних пріборах-
ж) пастеризація - стерилізація при 60-70 °, введена Пастером для знищення бесспорових мікробів в таких рідинах, які змінюються і псуються при більш високих температурах (вино, пиво, молоко). Широко застосовується пастеризація молока, так як така стерилізація при температурі не вище 65 ° зберігає його смакові і поживні властивості.
Апарат для згортання сироватки. Апарат являє собою бляшаний ящик з подвійними стінками, між якими налита вода (рис. 31). Дно в цьому апараті скошене, щоб пробірки можна було покласти в похилому положенні. Зовні він обшитий азбестом і закривається двома кришками-скляній, щоб можна було спостерігати процес згортання середовища, і зверху - металевою. У верхній частині ящика є отвір, через яке наливають воду. Воду в апараті нагрівають до температури 80- 90 ° газовим пальником або електричним приладом. При даній температурі прогрівання виробляють по 1 годині 3 дні поспіль.
Мал. 32. Фільтр Зейтца.
Мал. 31. Апарат для згортання сироватки.
Цим апаратом користуються для згортання сироватки, а також для приготування ряду яєчних поживних середовищ, причому одночасно з затвердінням середовища відбувається її стерилізація.
- Механічна стерилізація. Механічна стерилізація досягається за допомогою бактеріальних фільтрів, приготованих з дрібнопористою матеріалу. Мікроби не можуть проникнути через ці пори. Є різноманітні бактеріальні фільтри. Найчастіше користуються фільтром Зейтца (рис. 32) і мембранними фільтрами.
Фільтри Зейтца складаються з пластинчастих азбестових кружечків різної величини, що вставляються в спеціальні металеві утримувачі.
Для фільтрування кожен фільтр повинен бути спеціально змонтований - приладнаний до приймача, в який збирається фільтрат. Приймачами можуть служити скляні циліндри з боковим тубусом і розширеним на зразок воронки дном. Через тубус виробляють викачування повітря водоструминним або іншим насосом. Як приймач застосовують також плоскодонні конічні посудини з боковим тубусом у верхній частині, через який викачують повітря.
Для монтування пластинчастих фільтрів Зейтца є металеві тримачі. Вони ізготавляются з нікельованої металу і складаються з двох частин-верхньої циліндричної без дна і нижньої, що є дном апарату і пригвинчується особливими гвинтами. Це дно в середині звужується до вузького тубус, службовець для стоку фільтрату. Між обома частинами туго затискають асбестовую пластинку, накладають на металеву сітку, яка служить їй опорою. Всю установку стерилізують в автоклаві.
Після стерилізації місця зіткнення пробки з приймачем і тубусом повинні бути щільно з`єднані і залиті парафіном.
Мембранні фільтри являють собою пористі нітроцелюлозні плівки в формі гуртків діаметром 35 мм, товщиною 0,1 мм і нагадують тонку білу папір. За розміром пір розрізняють великопористі і дрібнопористі фільтри. Залежно від водопроникності розрізняють наступні фільтри: № 1, 2, 3, 4 і 5. Найщільніший фільтр - № 1, самий пухкий - № 5.
Крім цих фільтрів, випускається так званий попередній фільтр, призначенням якого є очищення води від грубовзвешенних частинок. Найпоширеніший в практиці фільтр № 3 з діаметром пір 0,7 мк (техніка користування мембранними фільтрами описана на стор. 436 в розділі «Посів води на мембранних фільтрах»).
