Дизентерійні бактерії - мікробіологія з технікою мікробіологічних досліджень

Дизентерійної БАКТЕРИИ (шигели)
Дизентерія - інфекційне захворювання, що характеризується ураженням товстого кишечника і явищами загальної інтоксикації. Збудником цього захворювання є група бактерій, об`єднаних загальним родовим назвою - Shigella на честь японського мікробіолога Шига, який довів роль цих бактерій в етіології дизентерії.
Розрізняють два види дизентерійних захворювань: 1) амебної дизентерію, викликану дизентерійної амебою і зустрічається переважно в теплих країнах, і 2) бактеріальну дизентерію, викликану дизентерійними бактеріями і поширену повсюдно.
Паличку дизентерії вперше виділив у чистій культурі А. В. Григор`єв в 1891 р Лише згодом були відокремлені види і типи дизентерійних паличок.
У 1962 р була затверджена радянська класифікація бактерій дизентерії (шигел), в основу якої було покладено антигенні і біохімічні ознаки, властиві основним представникам зазначеної групи мікроорганізмів.
Відповідно до цієї класифікації (табл. 16), шигели поділяються на дві групи:
1) неферментуючі маннит (маннітотріцательние) і 2) ферментують маніт (маннітположітельние).
До першої групи належать три види бактерій: Григор`єва-Шига, Штуцер-Шмітца і Лардж-Сакса, які за антигенною структурою поділяються на 8 типів, до другої - два види: бактерії Флекснера і Зонне. Вид Флекснера за своїми ферментативним і серологічним властивостям ділиться на три підвиди: власне Флекснер, Ньюкестл і Бойда.
За антигенної структурі підвид Флекснера ділиться на 5 серологічних варіантів, а підвид Бойда - на 15. Бактерії Ньюкестл, не маючи серологічних різновидів, за біохімічними властивостями діляться на три підвиди (див. Табл. 18). Бактерії Зонне серологічних варіантів не мають, але має схильність до дисоціації на щільних поживних середовищах. В процесі дисоціації утворюються гладкі і шорсткі колонії.

Вітчизняна класифікація дизентерійних бактерій (рід шигелл)

1. Не ясно, до якого виду належить,
2. Позбавлені типових антигенів.
3. Три ферментативних типу.

Мал. 80.

Гладкі колонії (S-форма) невеликі, прозорі, безбарвні з рівними краями (рис. 80) - шорсткі колонії (R-форма) - більші, плоскі, шорсткі, з порізаними краями, менш прозорі, ніж гладкі колонії.                                                   
Морфологія і тинкторіальних властивості. Дизентерійні палички за величиною, формі і фарбування подібні з усією тифозною групою. На відміну від останніх вони нерухомі.
Культуральні та біохімічні властивості. Ростуть дизентерійні палички на звичайних поживних середовищах, подібно тифозним бактеріям. На середовищах з вуглеводами характеризуються меншою ферментативної активністю в порівнянні з іншими представниками кишково-тифозної групи, при зростанні на бульйоні сірководню не утворюють.
Дизентерійні бактерії лактозу НЕ зброджують, інші вуглеводи розкладають тільки до кислоти. Палички Зонне викликають повільне і слабке кислотообразование в середовищі з лактозою (з другої доби).
Для відмінності дизентерійних паличок від тифо-паратіфозних і один від одного використовують: 1) ставлення їх до вуглеводів, 2) вивчення рухливості, 3) реакції аглютинації. Подібність і відмінність ознак дизентерійних бактерій показані в табл. 17 і 18.
Таблиця 17 Біохімічні властивості дизентерійних бактерій (шигелл)

Біохімічні варіанти підвиду Ньюкестл1
Позначення: + ферментує з утворенням кислоти-± ферментує НЕ завжди-- не ферментує.
Таблиця 18

Позначення: К - ферментують з утворенням кислоти, КГ - ферментують з утворенням кислоти і газу-позначення в дужках означають сповільнену реакцію, спостереження якої ведеться протягом 15 діб при 37 °.

Резистентність. Резистентність у різних дизентерійних паличок не однакова. Наприклад, палички Грігорьева- Шига на прямому сонячному світлі гинуть протягом 30 хвилин, а бактерії Флекснера і Зонне - за 3 години. У грунті палички Григор`єва-Шига зберігаються в середньому 45 днів, а Флекснера і Зонне - 65 днів. В льоду дизентерійні палички зберігаються тижнями і місяцями. Прогрівання при температурі 60 ° вбиває їх протягом 10 хвилин. Фенол і хлорне вапно в звичайних концентраціях вбивають дизентерійних бактерій протягом 30 хвилин.
Патогенність для тварин і токсінообразованіе. У природних умовах тварини не схильні до захворювань бактеріальної дизентерію. Штучне зараження через рот залишається безрезультатним. Дизентерійні бактерії Григор`єва-Шига виробляють екзотоксин. Екзотоксин досить резистентний по відношенню до високої температури і витримує нагрівання до 70 °. Решта видів дизентерійних паличок менш токсичні і виділяють тільки ендотоксин.
Патогенез і клініка. Джерелом інфекції при дизентерії є хвора людина, реконвалесцент і бактеріоносій. Зараження дизентерією відбувається контактно-побутовим шляхом або через інфіковані продукти і воду. Мікроби дизентерії проникають в організм через рот і локалізуються в слизовій оболонці товстого кишечника і тут викликають спочатку гостре катаральне, а потім дифтеритическое запалення. Надалі розвивається некротичний процес, в результаті чого утворюються виразки. Інкубаційний період при дизентерії короткий - від 2 до 5 днів. Характерні симптоми захворювання: слабкість, блювання, підвищення температури, апатія, рідкі, спочатку слизові, а потім кров`янисті випорожнення, стілець частий, до 40 разів на добу, що супроводжується сильними болями. Дуже характерні хворобливі тенезми - безуспішні позиви на дефекацію.
Токсичні і важкі форми дизентерії викликаються паличками Григор`єва-Шига, і деякими різновидами бактерій Штуцер-Шмітца. В даний час найбільш поширені форми дизентерії, викликані паличками Флекснера і Зонне.
Імунітет. При дизентерії імунітет слабо виражений, хоча в крові хворих виявляють різні антитіла (аглютиніни, бактеріолізини, опсоніни, комплементсвязивающіе антитіла і антитоксинів - при дизентерії, спричиненої паличкою Григор`єва-Шига і токсичних формах дизентерії Штуцер - Шмітца).
Цим, мабуть, і пояснюється можливість переходу гострої форми дизентерії в хронічну. Відсутність перехресного імунітету (проти кожного виду бактерій утворюються тільки специфічні антитіла) уможливлює повторні захворювання на дизентерію, якщо відбувається інфікування іншим видом.
Лабораторна діагностика. Для дослідження на дизентерію необхідно користуватися свіжими випорожненнями, по можливості щойно отриманими від хворого, в іншому випадку відсоток позитивних результатів значно знижується.
Для збирання калу рекомендується користуватися стерильними паперовими тарілками або серветками, які вкладаються в судно, промите гарячою водою (обробка судна або горщика дезінфікуючими розчинами не допускається, так як невеликі кількості останніх вбивають дизентерійні палички). При транспортуванні калу на великі відстані зібрані фекалії поміщають в широку пробірку з консервирующей рідиною (30% нейтрального гліцерину і 70% фізіологічного розчину) в кількості 1 3 фекалій на 2 3 (5-10 мл) цієї суміші. Пробірки повинні зберігатися в темному місці при низькій температурі. Посів випорожнень повинен бути проведений не пізніше 12-24 годин з моменту взяття.
Консервантом може служити 1,5-3% гіпертонічний розчин кухонної солі і отримала останнім часом широкого розповсюдження серед накопичення Лейфсона. До складу цього середовища входить селеністокіслий натрій, який стимулює зростання дизентерійних бактерій, одночасно пригнічуючи розвиток супутньої мікрофлори (кишкової палички, стафілококів, ентерококів та інших мікробів).
Приготування селенітовий середовища Лейфсона. В 1 л дистильованої води розчиняють 7 г безводного двузамещенного фосфорнокислого натрію, 3 г однозамещенного фосфорнокислого натрію (NaHP04), 5 г пептона (чехословацької фірми «Спофа» або угорської «Ріхтер»), 4 г лактози, розливають у флакони по 50 мл і стерилізують текучим паром два дні по 30 м при температурі 112 ° С протягом 30 хвилин.
Окремо готують на стерильній воді 10% розчин кислого селенітокіслого натрію (NaHSeCb). Перед вживанням на кожен флакон з 50 мл основного розчину додають 2 мл розчину селеністокіслого натрію і приготовлену середу розливають в стерильні пробірки по 5-7 мл п щільно закривають пробками,
Перш ніж приготувати середу для вживання, необхідно визначити точну пропорцію фосфатів, яка з випробуваним зразком пептона і кислого селеністокіслого натрію дає pH не вище 6,9-7,1, що регулюється зміною кількісного співвідношення фосфатів.
Така подтітровка проводиться кожного разу, коли змінюється серія одного з інгредієнтів середовища (пептон, кислий селеністокіслий натрій, фосфати).
Взяття матеріалу можна проводити за допомогою скляних трубочок з опаять кінцями або за допомогою ватного тампона.
Платинової петлею виловлюють слизовий або слизисто-гнійний грудочку, який повторно промивати в стерильному фізіологічному розчині і засівають послідовно на три чашки із середовищем Левіна або з бактоагар Ж.
Після 24-годинного вирощування посіву в термостаті досліджують круглі прозорі ніжні безбарвні колонії. Підозрілі колонії відсіваються на скошений агар, на маннит і короткий строкатий ряд з лактозою і глюкозою і через 24 години враховують отримані результати.
Одночасно з матеріалом з безбарвних колоній ставиться орієнтовна реакція аглютинації з видовими і при необхідності монорецепторними типовими сироватками. Позитивна реакція з однією з сироваток підтверджує приналежність мікроба до дизентерійної групи. Результат дослідження (попередній) можна видати через 24 години.
Замість короткого строкатого ряду можна використовувати середу Ресселя. Це середовище зручна тим, що замінює три пробірки. Замість скошеного агару служить скошена поверхня середовища Ресселя (з неї роблять препарати, орієнтовну агглютинацию). При зброджуванні лактози і стовпчик середовища і скошена поверхня фарбуються відповідно індікатору- при зброджуванні глюкози тільки стовпчик середовища забарвлюється відповідно кольору відновленого індикатора, а газ накопичується на дні і у вигляді бульбашок розриває агар. Глюкоза на середовищі Ресселя розщеплюється тільки в анаеробних умовах. Культури, зброджують на середовищі Ресселя лактозу протягом першої доби, вважають непатогенними і дають негативний аналіз. Ті ж культури, які ферментують тільки глюкозу до кислоти, підлягають подальшому вивченню. Готують препарат для фарбування по Граму і визначення рухливості і ставлять пробну агглютинацию на предметному склі. Доцільно застосувати суміш сироваток проти переважаючих в даній місцевості видів і типів шигелл (наприклад, Флекснера, Зонне, Ньюкестле). При позитивному результаті культуру відчувають окремо полівалентною сироваткою Флекснера, сироваткою Зонне і сироваткою Ньюкестле,
Щоб визначити тип і підтип виділеної культури Флекснера, її відчувають у реакції аглютинації на склі спочатку з типовими сироватками (I, II, III, IV і V), а потім з груповими (3, 4, 6, 7 і 8). Для остаточної ідентифікації виділеної культури її засівають в середовища Гісса з манітом, мальтозою і сахарозою і в пробірку з бульйоном Хоттингера для визначення індолу і сірководню.
Підставою для видачі позитивного аналізу служать наступні ознаки: виділення грамнегативної, нерухомою палички з типовими культуральними і антигенними властивостями, характерними для шигел.
У деяких хворих виділяються атипові палички, що не агглютинируются типоспецифічними сироваткою. У таких випадках приналежність мікроба до дизентерійної групи встановлюють пробою на фаголізису виділеної культури полівалентним дезинтерійних бактериофагом.
Виявлення бактерій дизентерії за допомогою збільшення титру фага. Екскременти без консерванту зважують і доливають до них м`ясо-пептони бульйон (pH 6,8-7,0) з розрахунку 10 мл на 1 г випорожнень, струшують з намистом, відстоюють 5-10 хвилин. Отриману суспензію наливають в 2 широкі пробірки по 9 мл в кожну. У 1-ю додають 1 мл індикаторного фага (для виявлення бактерій дизентерії) в розведенні 1: 100, в 2-у - 1 мл бульйону. У 3-ю пробірку наливають 9 мл бульйону і 1 мл індикаторного фага в робочому розведенні. З цих трьох пробірок 1-я є досвідченою, 2-я служить контролем на наявність вільного фага, 3-я - контролем титру індикаторного фага. Пробірки ставлять в термостат при температурі 37 ° на 4,5-5 годин для наростання фага. Після цього вміст кожної пробірки розводять бульйоном в 500-1000 разів і більше так, щоб в 1 мл з 3-й пробірки (контроль фага) вийшло таку кількість негативних колоній фага, яке можна порахувати (10-20 корпускул). Вміст пробірок для інактивації мікробів прогрівають на водяній бані при 56-58 ° протягом 30 хвилин. Потім застосовують метод агарових шарів, який дозволяє визначити кількість корпускул дизентерійного бактеріофага. Цей метод полягає в наступному. Три чашки Гейденрейха - Петрі заливають 1,5% м`ясо-пептони агаром, добре підсушують, а потім наливають другий шар,
який складається з 2,5 мл розплавленого 0,7% агару, 0,1 мл змиву еталонної культури дизентерійних бактерій і 1 мл прогрітій суміші з пробірок 1, 2, 3-й (в кожну чашку по одній суміші). Через 20-30 хвилин чашки поміщають в термостат на 47 г-5 годин, а потім враховують результати реакції по стерильним плям в чашці з випробуваним матеріалом (1-я чашка) і в контрольних (2-а і 3-я).
Збільшення титру бактеріофага (корпускул фага) більш ніж в 5 разів в 1-й чашці в порівнянні з контролем вказує на присутність в досліджуваному матеріалі дизентерійних паличок.
При хронічній дизентерії для діагностики захворювання з сироваткою хворого можна поставити: 1) опсоно-фагоцитарную реакцію- 2) реакцію зв`язування комплементу, 3) реакцію аглютинації.
Методика постановки реакції аглютинації аналогічна постановці реакції Відаля з тією лише різницею, що пробірки витримують у термостаті 18-20 годин.
В даний час при діагностиці дизентерії широко використовується реакція пасивної гемаглютинації з еритроцитарних діагностикумами Зонне.
Виділені культури дизентерійних бактерій перевіряють також на чутливість до антибіотиків.
Специфічна профілактика і терапія.
У безпосередньому оточенні передбачуваного дизентерійного носія або хворого на хронічну дизентерію як профілактичний засіб застосовують. бактеріофаг.
Для лікування дизентерії застосовують сульфаніламідні препарати (сульгин, фталазол та ін.), Антибіотики (синтоміцин, біоміцин, левоміцетин, стрептоміцин). У разі важкої токсичної форми захворювання вводять антитоксичну протіводізентерійное сироватку. При лікуванні хронічних форм дизентерії користуються спиртової вакциною В. А. Чорнохвостова.