Лабораторна діагностика туберкульозу - фтизіатрія
9.4. Лабораторна діагностика туберкульозу
Найбільш характерні зміни в аналізах крові. Основними причинами змін складу крові у хворих на туберкульоз є інтоксикація і гіпоксія.
У хворих з початковими формами туберкульозу в крові міститься нормальна кількість еритроцитів і гемоглобіну. У міру наростання патологічних змін в легеневій тканині порушується газообмін, в результаті чого у хворих на туберкульоз може розвинутися гіперхромні анемія (збільшення кількості гемоглобіну при зменшеній кількості еритроцитів). При різкому схудненні хворого можуть спостерігатися явища гипохромной анемії, яка характеризується зменшенням кількості еритроцитів і гемоглобіну. Біла кров більш часто піддається змінам. При початкових фазах інфільтрату, загостреннях осередкового, хронічного, дисемінованого і кавернозного процесу, при казеозний пневмонії може спостерігатися лейкоцитоз в межах 12 000 - 15 000. При всіх інших формах туберкульозу, якщо немає супутніх захворювань, кількість лейкоцитів рідко буває вище норми. Більш характерний нейтрофільний зсув вліво, який спостерігається при початкових формах і загостренні туберкульозного процесу. З`являються паличкоядерні і навіть юні нейтрофіли. Кількість еозинофілів може збільшуватися у деяких хворих при антибактеріальної терапії, а також при супутніх алергічних захворюваннях.
Важкі форми туберкульозу протікає з еозинопенією і лимфопенией. Лімфопенія характерна для казеозних форм бронхоаденіту, казеозний пневмонії, міліарний туберкульоз. При малих і свіжих формах туберкульозу зазвичай спостерігається лімфоцитоз.
Підвищена ШОЕ залежить від процесу туберкульозу, тільки при туберкульозному менінгіті вона гризе бути в межах норми.
виявлення мікобактерій
Виявлення мікобактерій має вирішальне значення не тільки для діагностики туберкульозу, воно надзвичайно важливо при прогнозуванні перебігу процесу, виборі раціональної схеми лікування та правильній оцінці його ефективності.
Основними методами лабораторної діагностики туберкульозу є класичні мікробіологічні методи: бактеріоскопія- культуральне дослідження, або посев- біологічна проба на чутливих до туберкульозної інфекції лабораторних тварин.
Збір матеріалу для дослідження. Дотримання правил збору, зберігання і транспортування діагностичного матеріалу має дуже важливе значення, так як від цього залежить не тільки достовірність отриманих результатів, а й епідеміологічна безпека оточуючих.
Матеріал для дослідження на наявність мікобактерій туберкульозу збирають в стерильні контейнери (скляні банки) з щільно кришками. Застосування граматичних контейнерів переслідує двояку мету: запобігання просочування вмісту і забруднення навколишнього хворого середовища надзвичайно стійкими до фізичних дій мікобактеріямі- ізоляцію зберігається в контейнері досліджуваного матеріалу від широко розповсюджених вегетуючих в навколишньому середовищі кислотостійких бактерій.
Для дослідження може бути використаний різноманітний патологічний матеріал: харкотиння, аспірат, вміст бронхів і інші матеріали, одержувані при бронхоскопіческом дослідженні, промивні води бронхів і шлунка, ексудати, гній, виділення ран, спинномозкова рідина, кров, сеча, операційний матеріал, змиви з предметів , органи експериментальних тварин та ін.
У хворих з легеневими формами процесу об`єктом дослідження частіше служить мокрота. Збір мокротиння - дуже відповідальний етап діагностичної процедури, від чіткого проведення якого багато в чому залежить результат дослідження. У зв`язку з цим бажано, щоб збір мокротиння проводився в окремій (кашльовий), добре вентильованого кімнаті. Для дослідження збирають ранкову порцію. Якщо хворий виділяє мало мокротиння, її слід збирати протягом доби, при цьому обов`язково зібраний матеріал зберігати в холодильнику. Якщо дослідження проводиться на тлі лікування, за 2 доби до збору мокротиння прийом протитуберкульозних препаратів скасовується.
Згідно з рекомендаціями, розробленими Міжнародною спілкою по боротьбі з туберкульозом, збір мокротиння повинен проводитися в присутності і за безпосередньої участі середнього медичного персоналу. При цьому особам, відповідальним за збір мокротиння, слід керуватися наступними правилами.
Відео: Оцінка ризику трансмісії туберкульозу та розробка плану інфекційного контролю
- Пояснити хворому причини дослідження і необхідність відкашлювати вміст глибоких відділів дихальних шляхів, а не збирати в контейнер слину або носоглоткову слиз. Необхідно також попередити хворого, що він повинен попередньо почистити зуби і прополоскати порожнину рота кип`яченою водою, що дозволяє механічно видалити основну частину мікрофлори, вегетуючій в ротовій порожнині.
- Присутній при зборі мокротиння медичний працівник повинен відкрити стерильний контейнер, зняти з нього кришку і передати хворому тільки донну частину контейнера.
- Стоячи позаду хворого, слід рекомендувати йому тримати контейнер якомога ближче до губ і відразу ж спльовувати в нього мокроту в міру її відкашлювання.
- По завершенні збору мокротиння медичний працівник повинен оцінити її кількість і якість-контейнер з порцією мокротиння достатнього обсягу (не менше 3 - 5 мл), що містить ущільнені або гнійні грудочки без слини, ретельно закривають кришкою, що загвинчується, маркують і поміщають в спеціальний ящик для транспортування в лабораторію.
Якщо хворий не виділяє мокроту або виділяє її тільки епізодично і в убогому кількості, то напередодні і рано вранці в день збору мокротиння хворому слід дати відхаркувальний засіб або застосувати дратівливі аерозольні інгаляції. Останні провокують посилення секреції бронхів, кашель і виділення мокротиння.
Для аерозольних інгаляцій користуються портативними аерозольними інгаляторами типу АІ-1. Як ингалируемой суміші рекомендується 15% -й розчин хлориду натрію в 1% -му розчині бікарбонату натрію (150 г NaCl і 10 г NaHCО3 на 1 л дистильованої води).
Якщо при дратівливою інгаляції чомусь не вдається одержати мокротиння, то використовують промивні води бронхів або шлунка. Останній метод застосовується переважно у дітей молодшого віку, які погано відкашлюють мокроту і часто заковтують її.
Збір промивних вод бронхів проводиться лікарем-отоларингологом. Промивні води шлунка беруть натщесерце за допомогою товстого зонда, попередньо давши хворому випити або ввівши через зонд 100 - 150 мл розчину бікарбонату натрію (питної соди) з метою нейтралізації кислої реакції шлункового вмісту. Промивні води шлунка повинні досліджуватися негайно, щоб виключити шкідливу дію на збудника шлункових ферментів.
Більш цінним матеріалом для дослідження при відсутності мокроти є аспірати з трахеї і бронхів, бронхоальвеолярного лаважной рідини, а також матеріали прицільної катетеро- і щіткової біопсії, одержувані при бронхологіческіх дослідженнях.
Дослідження калу на мікобактерії необхідно проводити при наявності ознак туберкульозу кишечника. У бактеріовиділювачів, які частково заковтують мокроту, мікобактерії туберкульозу можуть виявитися в калі і при непораженном кишечнику. При туберкульозі кишечника в калі нерідко виявляються слиз, кров і навіть домішка гною. Для дослідження беруть кілька грудочок калу зі слизом або гноєм, розмішують з 5% -м розчином хлориду натрію і фільтрують. Отриманий фільтрат змішують з рівною кількістю етилового спирту і центрифугують. Надалі з осаду роблять мазок, який забарвлюють за методом Ціля-Нільсена. В даний час туберкульоз кишечника зустрічається виключно рідко, а тому дослідження калу на БК практично не проводиться.
Виявлення мікобактерій в спинномозковій рідині свідчить про туберкульозному менінгіті. Однак слід пам`ятати, що бактеріоскопічному методом вдається виявити мікобактерії лише у 10 - 15% хворих на туберкульозний менінгіт.
Для дослідження пробірку зі спинномозковою рідиною ставлять у вертикальне положення на 8 - 10 год в прохолодному місці. Якщо в ній утворюється фібрину плівка, вона адсорбує формені елементи і мікобактерії. Фібрину плівку поміщають на предметне скло і готують препарат з забарвленням за Цілем - Нільсеном. Якщо плівка не випадає, препарат готують із центрифугата.
Для виявлення мікобактерій в плевральному ексудаті, в пунктатах і виділеннях з свищів препарат готують так само, як і при дослідженні мокротиння.
Ексудати з плевральної порожнини, виділення ран, аспірати і пунктати із закритих натечником, гнійних вогнищ, асцитичної рідина та інші матеріали повинні бути взяті у хворого з дотриманням всіх правил асептики, поміщені в стерильний посуд і доставлені в лабораторію.
Особливої методичного підходу вимагає дослідження менструальної крові. Наявність в цьому матеріалі великої кількості протеолітичних, фибринолитических і інших ферментів вимагає негайної доставки матеріалу в лабораторію і ретельної його обробки, так як менструальна кров є вельми сприятливим середовищем для мікробної флори.
Особливої уваги потребує збір сечі. Для дослідження використовують зазвичай середню порцію ранкової сечі, отриманої після ретельного туалету зовнішніх статевих органів розчинами антисептиків (слабкий розчин перманганату калію, риванолу та ін.). Сечу центрифугируют, осад використовують для мікроскопії і обробляють 3 -5% -м розчином сірчаної кислоти, але не лугом. Збір добової сечі для бактеріологічного дослідження малораціонален. Встановлено, що при зберіганні сечі більше 1 ч після збору число мікробних клітин неспецифічної мікрофлори збільшується в кілька разів. Ферменти життєдіяльності цієї флори можуть пригнічувати ріст мікобактерій.
Зберігання, консервація і транспортування діагностичного матеріалу. У протитуберкульозних закладах функціонують спеціалізовані лабораторії, що проводять бактеріологічні дослідження.
В стаціонарах стерильні контейнери з мокротою або іншим патологічним матеріалом доставляються безпосередньо в лабораторію. Збір матеріалу від амбулаторних хворих проводиться, як зазначено вище, під безпосереднім наглядом середнього медичного працівника.
Якщо в лікувальному закладі не проводяться дослідження для виявлення кислотостійких мікобактерій, зібраний діагностичний матеріал повинен централізовано доставлятися в лабораторію. Зазвичай така доставка здійснюється один або два рази на тиждень. Отже, матеріал повинен накопичуватися протягом декількох днів. Для цього використовують бікси або спеціальні транспортувальні ящики, що вміщають 10 - 20 контейнерів, які зберігаються в холодильнику.
Під час транспортування матеріал необхідно захищати від впливу прямих сонячних променів і тепла. Якщо транспортування і зберігання займають не більше 48 ч, матеріал можна пересилати без консерванту. У літній період і в районах з теплим кліматом консервація необхідна, якщо транспортування займає більше 24 ч. З цією метою можна застосовувати 2 -3% -й розчин борної кислоти в співвідношенні 1: 1 або гліцерин. Як консервант можна також використовувати 10% -й розчин трехзамещенний фосфату натрію або 0,05 -0,1% -й розчин хлоргексидин біглюконат в співвідношенні 1: 1 в цих випадках посів матеріалу виробляють без подальшої обробки. Зростання мікобактерій може бути отриманий навіть після зберігання мокротиння з консервантом при температурі 30 "З протягом 10-12 днів.
В умовах Крайньої Півночі діагностичний матеріал при тривалому транспортуванні можуть порушити значних коливань температури. При цьому необхідно враховувати, що допускається пересилання матеріалу в замороженому стані без консерванту. Це забезпечує збереження життєздатності мікобактерій протягом 8-15 днів, однак ні в якому разі не можна допускати повторне відтавання і заморожування матеріалу, які сприяють зниженню життєздатності мікобактерій.
Бактеріоскопічне дослідження. Воно є одним з основних і найбільш поширених методів. Переваги його полягають в простоті, дешевизні і швидкості отримання результатів. Однак можливості методу обмежені. У препараті можна виявити поодинокі мікобактерії, якщо в 1 мл матеріалу міститься не менше 10 000 - 100 000 бактеріальних клітин (межа методу).
Найбільш поширеним методом забарвлення для виявлення кислотостійких мікобактерій є спосіб Циля - Нільсена. Мокротиння на предметному склі забарвлюють карболовим фуксином, при одночасному впливі нагрівання обесцвечивают мазок в 3% -му розчині солянокислого спирту (призводить до знебарвлення всіх некіслотоустойчівих структур) і дофарбовують метиленовим синім. Тільки мікобактерії, що володіють вираженою кислото- і спиртостійкі, стійко утримують барвник і залишаються пофарбованими в червоний колір. Мікобактерії виявляються в препараті у вигляді тонких, прямих або злегка вигнутих яскраво-червоних паличок.
Мікроскопію забарвлених препаратів виробляють в світловому мікроскопі з імерсійним об`єктивом х90 і окуляром х10 (збільшення х900).
В даний час застосовується метод забарвлення люмінісцентними барвниками. Порівняльні дослідження показали значно більш високу інформативність люмінесцентного методу, яка, за даними різних авторів, коливається від 9 до 19%.
У тих випадках, коли в патологічному матеріалі я не бачу мікобактерії методом бактеріоскопії, виробляють бактеріологічне дослідження. Культуральний метод - посів матеріалу на живильні середовища. Перевага методу в високої чутливості. Досить 20-100 мікобактерій в 1 мл матеріалу. Недолік методу полягає в тривалості зростання колоній: 1 - 3 міс.
Застосування двох методів в сукупності дозволяє більш точно кількісно оцінити ступінь бактеріовиділення.
Матеріал висівають на живильні середовища і виділяють культуру мікобактерії в чистому вигляді для диференціації її від кислотостійких сапрофітів. Перевага бактеріологічного методу в порівнянні з бактеріоскопічному полягає в тому, що при наявності в патологічному матеріалі життєздатних мікобактерій можна діагностувати бацілловиделеніе. Недоліком методу є повільне зростання мікобактерії.
Досліджуваний матеріал висівають на спеціальні середовища після попередньої обробки. Найбільш часто використовують яєчні середовища (Петраньяні, Левенштейна, Гельберга), які містять фарби, які гальмують ріст інших бактерій. В окремих випадках застосовуються посіви на рідкі поживні середовища, а також проводиться мікрокультівірованіе на стеклах.
Попередня обробка патологічного матеріалу зводиться до знищення супутньої флори. Посів промивних вод шлунка, бронхів, а також сечі проводиться з центрифугата або осаду. При цьому сечу, якщо вона не забруднена, можна не обробляти. Промивні води шлунка необхідно нейтралізувати 10 - 15% -м розчином бікарбонату натрію, так як під впливом шлункового соку через 6 ч знижується життєдіяльність мікобактерій. Спеціальної обробки тут також не потрібно.
Існує кілька методів попередньої обробки плеврального ексудату і мокротиння. Для прикладу опишемо методи Мазура і Петрова. У стерильну пробірку заливають 3 - 4 мл 2% -го розчину сірчаної кислоти, туди ж поміщають частину патологічного матеріалу. Пробірку струшують протягом 3 хв, після чого стерильною платинової петлею роблять посів на яєчні середовища (метод Мазура).
Метод Петрова полягає в тому, що матеріал заливають 4% -м розчином їдкого натру і ставлять в термостат на 1 ч, після чого утворилася гомогенну суміш нейтралізують 4% -м розчином соляної кислоти. Середу контролюють лакмусовим папірцем. Осад нейтральної рідини засівають в пробірки на яєчні середовища.
Яєчного середовища ставиться в термостат при температурі 37 ° С. Перші колонії мікобактерій з`являються на 18 -30-й день, а іноді і через 3 місяці.
Бактеріологічне та бактеріоскопічне дослідження необхідно проводити в поєднанні. Якщо при бактеріоскопії мікобактерії не виявлені, а при посіві спостерігається їх зростання, то це означає, що хворий виділяє невелику кількість мікобактерій туберкульозу. У випадках, коли при бактеріоскопії мікобактерії виявляються, а результати посіву негативні, то це свідчення того, що хворий виділяє кислотостійкі бактерії зниженою життєздатності або ж загиблі мікобактерії туберкульозу.
Біологічний метод зараження тварин зараз застосовується тільки в науково-дослідних інститутах.
Щеплення патологічного матеріалу тваринам проводиться в пахову область в дозі 2 - 3 мл.
В даний час почалося використання молекулярно-біологічного методу гібридизації ДНК, або, по-іншому, полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Спочатку виділяється ДНК мікобактерії, потім вона клонується і ідентифікується. Метод дуже чутливий (досить 1 МБТ), однак без одночасної оцінки клінічної картини захворювання використовувати
його треба обережно. Він не розрізняє мертві МБТ, штам БЦЖ і може виявити випадково потрапили мікроби. Це - перспективний метод, але його роль ще до кінця не визначена.
Визначення лікарської стійкості мікобактерій
В даний час розроблені і впроваджені в практичну діяльність диспансерів методи визначення лікарської чутливості (стійкості) мікобактерій до туберкулостатичних препаратів. Розрізняють первинну лікарську стійкість у хворих, які не лікувалися протитуберкульозними препаратами, і вторинну, развівающуяся в процесі лікування. Частота первинної стійкості становить 20 -80%.
Найбільш поширений метод серійних розведень абсолютних концентрацій туберкулостатичних препаратів на поживних середовищах.
Лікарська стійкість мікобактерій туберкульозу визначається прямим і непрямим методами.
Прямий метод полягає в посіві обробленого матеріалу (мокротиння, промивних вод бронхів, гною), що містить мікобактерії туберкульозу, на щільну середу Левенштейна-Єнсена або Гельберга, що містить лікарські препарати. Цей метод може бути застосований, коли мікобактерії в матеріалі виявляються в значній кількості (1 - 5 мікробних тіл в полі зору).
Непрямий метод зводиться до того, що спочатку отримують культуру в чистому вигляді, а потім для визначення лікарської стійкості проводять посів. Тому результат дослідження при прямому методі отримують раніше - через 15 - 20 днів, при непрямому - через 3 - 4 тижні. або 2 - 3 міс.
Живильні середовища Левенштейна -Іенсена для визначення лікарської стійкості готують з додаванням туберкулостатичних препаратів різних концентрацій, тобто методом серійних розведень. Крім того, щоб уникнути проростання сторонньої флори, додають 10ЕД пеніциліну на 1 мл середовища.
Цим способом визначають концентрацію туберкулостатичного препарату, при якій ще спостерігається зростання мікобактерій туберкульозу, і концентрацію, при якій ріст мікобактерій не відбувається.
Лікарська стійкість мікобактерії може бути: моно - до одного препарату, множинна - до суміші ізоніазиду і рифампіцину, полірезистентна - до двох і більше препаратів крім рифампіцину та ізоніазиду, перехресна - до препаратів з подібною хімічною структурою.
В даний час впроваджуються генетичні методи визначення лікарської стійкості за допомогою ПЛР-методу.
В практику лікувально-діагностичних установ впроваджено також визначення ступеня інактивації ізоніазиду. Ступінь інактивації ізоніазиду визначається дослідженням сечі. За 3 дні до дослідження хворому відміняють призначення всіх препаратів, крім ізоніазиду, його продовжують призначати звичайну дозу. Потім вранці йому дають тест-дозу (0,6 г) ізоніазиду.
У сильних інактиваторів з сечею виділяється 10%, у середніх - 14 і у слабких 40% ізоніазиду.
