Молекулярна біологія і молекулярна генетика деменції - психіатрія пізнього віку

7 Молекулярна біологія і молекулярна генетика деменції
Саймон Аавстоун

Вступ

Молекулярна біологія - це застосування методів маніпуляцій з ДНК в експериментальної біології і опис відповідної методології. Цей термін використовується також для опису результатів таких досліджень. Аналогічно, молекулярна генетика - це експериментальна методологія для вивчення спадкових рис на рівні ДНК, знову ж таки, цей термін використовується більш широко для опису результатів цих досліджень. І молекулярна біологія, і молекулярна генетика все більш стають технологічно оснащені, і їх вплив на біологічну науку важко переоцінити. Дійсно, вони представили докази, які є революційними. Використовуючи технічні досягнення, можна досліджувати функції на молекулярному рівні, додатково до структурних досліджень, і, що найбільш вражає, можна конструювати моделі окремих процесів в клітинах і живих організмах. У найдрібніших деталях можна вивчити функції індивідуальних білків і їх взаємодії з іншими компонентами клітин, а також дослідити дрібні і великі зміни в білкової послідовності.
В області нейронаук молекулярна біологія і генетика значно просунулися вперед. Завдяки їх величезному внеску в психіатрію пізнього віку, особливо в останнє десятиліття, покращився розуміння хвороби Альцгеймера (БА) в такій мірі, що патогенез цього стану можна експериментально відтворити на молекулярному рівні. Змінилося наше розуміння і інших, більш рідкісних, деменций, особливо спонгіформних (губчастих) енцефалопатій. Однак слід зазначити, що молекулярні науки надали невеликий вплив на результати дослідження інших психічних розладів. Причини цього не повністю зрозумілі, але, ймовірно, пов`язані зі складністю, неоднорідністю і неясною природою афективних розладів і психозів, поряд зі складністю взаємодії середовищних і особистісних факторів. Коли дослідники молекулярних процесів зможуть об`єднати зусилля з епідеміологами, бихевиористами і вченими інших психологічних дисциплін, тоді результати молекулярно-біологічних і молекулярно-генетичних досліджень психічних порушень у похилому віці будуть воістину чудовими. Поки ж цілком достатньо того «вибуху» в дослідженнях деменцій, який ми зараз спостерігаємо.

Хвороба Альцгеймера

Сенільні бляшки і відкладення амілоїду

Амілоїдні бляшки, великі екстрацелюлярний структури з серцевиною з амілоїдного речовини, оточеного дегенерує нейронами, - напевно, найбільш вражаючі нейроморфологіческіх зміни, які описав Альцгеймер. Амілоїд - це «особлива речовина в корі мозку» (Alzheimer, 1907), яке відкладається в серцевині бляшок у вигляді фібрил товщиною 9-10 нанометрів і виявляється по бірефракціонному зелено-червоного фарбування під поляризованим освітленням. Це загальна властивість всіх амілоїдних протеїнів і результати вторинної структури поліпептидів, прийнятої ними in vivo. До того ж до накопичення всередині бляшок, амілоїдні фібрили при хворобі Альцгеймера також відкладаються в стінках дрібних кровоносних судин кори, і ці судини також виявляють за подвійною рефракції в поляризованому світлі. Внаслідок утворення антитіл до серцевини протеїну бляшок було проведено імуногістохімічне дослідження і вперше виявлені дифузні аморфні структури, які невидимі при стандартному фарбуванні тканин мозку гематоксилин- еозином або імпрегнації сріблом. Такі патологічні зміни, відомі як дифузні бляшки, зазвичай виявляють у молодих пацієнтів з хворобою Дауна перед появою поширених бляшок і формуванням клубків. Це послужило поштовхом до припущень, що вони - ранні попередники сенильних бляшок у осіб, які страждають на хворобу Альцгеймера (Mann et aL, 1990). Були тривалі суперечки про роль відкладень амілоїду в молекулярному патогенезі БА, але більшість дослідників з готовністю погодяться з тим, що відкладення амілоїду - необхідна, якщо не достатня, умова для розвитку хвороби (Selkoe, 1994).
Амілоїдних протеїн був вперше виділений зі стінок менінгеальних кровоносних судин хворого БА (Glenner and Wong, 1984), а незабаром був виділений з самих бляшок (Masters et al, 1985). Цей 39-43-амінокислотний пептид, амілоїдних протеїн, амілоїд, і сам по собі відбувається з більшого мембранозв`язані протеїну - білка попередника амілоїду (БПА- Kang et al, 1987). Значні зусилля були докладені до з`ясування клітинної ролі БПА, його нормального і патологічного метаболізму і ефектів агрегації АР in vivo.
Множинні ізоформи БПА генеруються шляхом альтернативного сплайсингу одиночного гена в 21-й хромосомі. У деяких ізоформах є зона, гомологичная інгібітору протеаз типу Кунітц (ІПК), але в мозку хворого БА зайва мРНК (а отже, найбільш надлишковий протеїн), схоже, належить до БПА695, у якого бракує ІПК-домену (Palmert et al, 1988) . БПА широко представлений у багатьох тканинах і in situ знаходиться трансмембранно, його невелика аміно-закінчення направлено всередину клітини, а велике карбоксіокончаніе - в екстрацелюлярне простір. Фрагмент АР знаходиться в протеїні в зоні, фіксованою всередині зовнішньої клітинної мембрани (рис. 7.1). Точна функція БПА все ще не визначена. У будь-якому випадку вона швидше за все різна в різних тканинах. Припущення про загальну, або формотворною, функції БПА зроблено на основі спостережень, що протеїн виявляє значний еволюційний консерватизм з міжвидові схожістю, і того факту, що він є частиною сім`ї гомологічних протеїнів (в тому числі подібних попередникам амілоїду (ПППА) 1 і 2). Розчинні форми БПА, що містять ІПК-домен, ідентичні протеїну, який раніше вважався протеазосвязивающім протеїном 2. Відомі функції цього протеїну за аналогією наводять на думку, що роль БПА полягає в забезпеченні сильної взаємодії між клітинами. Подальші припущення, що БПА діє як медіатор клітинних контактів, виходять зі свідчень його здібностей впливати на адгезивні і ростові якості нейрональних клітин в культурі (Schubert et al, 1989- Milward et al., 1992 Chen and Yankner, 1991).

Структура генів і шляхи продукції протеїнів складніші, ніж будь-хто міг припустити, коли Уотсон і Крик описали хімічну структуру ДНК і її роль в спадковості. Генетичний матеріал міститься в унікальних структурах, закодованих нуклеотидними підставами в ДНК Велика частина ДНК, проте, є не кодують матеріал Частково він, як встановлено, виконує функцію генетичних пускових та інших контрольних механізмів Тим часом як значна частина ДНК складається з некодуючих зон всередині генів, відомих як інтрони, а значна кількість ДНК знаходиться між генами з невідомою функцією. Власне гени складаються з ДНК, що кодує структуру протеїнів (екзонів), що не кодує ДНК між екзонами (інтронів) і контрольних послідовностей. Екзонів транскрибируются в РНК, яка, в свою чергу, трансформується в протеїн. Різні ізоформи протеїнів можуть продукуватися шляхом альтернативного сплайсингу - механізму, яким РНК різних видів продукується шляхом транскрипції різних екзонів або зон кодування ДНК.
Таким чином, в результаті транскрипції всіх екзонів гіпотетичного 4-екзонів гена з`являється найбільша изоформа, транскрипція екзонів 1, 2 і 4 продукує меншу ізоформу, а транскрипція екзонів 1 і 4 - ще меншу Виявляється, що в багатьох відносинах природа - консерватор і у деяких генів є загальні кодують послідовності або гомології. Вони стали могутнім інструментом в біології, так як по комп`ютерним програмам можна сканувати вже нескінченні геномні бази даних в пошуках гомологічних областей. У генів зі схожими послідовностями зазвичай подібні функції. У міжвидової гомології передбачаються тісні еволюційні взаємозв`язки між видами щодо гена такої важливості і корисності, що його структура протягом еволюції не змінилася.
Вражаючий приклад корисності пошуків гомологічних зон являє генетика БА На початку літа 1995 року було ідентифіковано мутації гена в 14-й хромосомі. Переглядаючи геномні бази даних, інша група дослідників часто виявляла схожий ген в 1-й хромосомі. Цей ген, що раніше не представляв ніякої цікавості для вивчення БА, був у членів сімей страждають на хворобу Альцгеймера, і була визначена мутація, яка викликає захворювання За кілька тижнів був ідентифікований ген, асоційований з сімейної хвороби Альцгеймера, - наукове досягнення, на яке в іншому випадку могло піти багато років, навіть при сьогоднішньому стрімкому темпі руху.
Звідси випливає, що якщо можуть бути гомологічні одна одній гени, то можуть існувати такі ж протеїни. Все більше з`являється доказів того, що багато протеїни є членами цілих сімейств протеїнів з подібною амінокислотною послідовністю, структурою і (часто) функцією.
Одним з найбільш повних звітів про дивовижної науці про генах можна знайти в регулярно видаються «генах» (видавництво У Lcwin, Оксфордський університетське видавництво).

Мал. 7.1. Білок - попередник амілоїду (БПА). Зображені положення протеїну в мембрані, місця розщеплення і положення при мутації

Саме тільки фрагмент АР відкладається в бляшках і стінках судин осіб, які страждають на хворобу Альцгеймера. Тому ймовірно, що цей фрагмент з`являється в результаті патологічного зміни батьківської молекули БПА. Однак зараз зрозуміло, що Ар - сам по собі нормальний, а не патологічний продукт БПА. На жаль, ще менше відомо про біологічну роль Ар, хоча були продемонстровані його цікаві нейротропні якості (Whitson et al., 1989- Yanker et al., 1990).
Саме результати досліджень по внутрішньоклітинного транспорту БПА розсіяли раніше існувала думка, що Ар є патологічним продуктом метаболізму. Показано, що Ар секретується різноманітними клітинами та трансфіковані клітинними моделями крім того, що він присутній в лікворі пацієнтів і здорових з контрольної групи (Haass et al., 1992а, Seubert et al, 1992, Shoje et al, 1992, Busciglio et al, 1993 ). Мембранозв`язані БПА розщеплюється щонайменше двома ферментами - а-секретази (Esch et al., 1990) і p-секретази (Seubert et al, 1993). Місце розщеплення а-секретази знаходиться всередині самого фрагмента Ар, виробляючи продукти розщеплення без интактного АР, тоді як в результаті розщеплення за місцем p-секретази продукується карбоксильний кінцевий фрагмент з інтактною амілоїдних (Ар) послідовністю. Мембранозв`язані БПА також може реінтерніроваться в клітку всередині ендосом (Haass et al., 992b) - бульбашок, які направляються до ліпосоми, що містить протеази. Інтактні містять Ав-протеолітичні фрагменти генеруються цим шляхом (Golde et al, 1992). Можливо, це і є той шлях, яким генерується нормальний секретується Ав (Коо et al., 1994).
Таким чином, в результаті метаболізму БПА генерується безліч внутрішньоклітинних продуктів, причому деякі з них містять интактную Ав-послідовність (амілоїдогенних метаболізм). У секретується продуктах багато як карбоксіокончаній БПА (БПАс), розщепленого а-секретази, так і Ар.
У нормальному лікворі в основному знаходиться АР, що складається з 40 амінокислот (АР 1-40- VigoPelfrey et al., 1993). при хворобі Альцгеймера, проте, АР відкладається у вигляді протеїну, що складається з 39-43 амінокислот, а в достатку зустрічаються в бляшках і стінках судин найбільш часто містять АР 1-42 (Miller et al, 1993- Roher et al., 1993). Крім того, щодо нерозчинний АР 1-42 відкладається на початку хворобливого процесу (Ivatsubo et al, 1995). Хоча АР - нормальний клітинний продукт, ймовірно, що освіта порівняно більших изоформ буває причиною хворобливого процесу.
Розуміння метаболізму БПА ще більш ускладнюється тим спостереженням, що секреція протеолізірованних а-секретази фрагментів (БПАс) посилюється стимуляцією холинергических рецепторів. Мускаринові рецептори, зокрема М1 / М3, схоже, підвищують секрецію БПАс і знижують кількість пов`язаного клітинами БПА (Nitsch et al, 1993, Haring et al, 1994). Оскільки місце розщеплення, за яким утворюється БПАс, знаходиться всередині послідовності Ар, як обговорювалося вище, результатом стимуляції М1 / М3 буде зменшення загальної кількості Ав-містять метаболічних продуктів - зниження рівня «амілоїдогенних» метаболізму БПА. Мускаринові рецептори зібрані в групи протеїнів, - що зв`язують в основному протеїни, кінази і фосфатази, - які передають сигнал активації рецепторів клітці. Було показано, що пряма активація елементів цих сигнальних каскадів низхідним шляхом від мускаринових рецепторів також впливає на метаболізм БПА (Buxbaum et al). Більш того, встановлено, що амілоїдогенних метаболізм в фібробластах, взятих від індивідів зі шведською мутацією БПА, може бути знижений сполуками, які діють цим шляхом (Felsenstein et al, 1994). Зв`язавши структурні зміни при хворобі Альцгеймера (відкладення амілоїду в бляшках) з відомими функціональними змінами (переважним виснаженням холинергического шляху), можна отримати перспективні можливості терапії.
Якщо БПА - широко представлений і еволюційно незмінний протеїн, а Ар - нормальний метаболічний продукт, то яку роль ці протеїни відіграють в БА? Переконливі свідчення патологічної ролі амілоїду виходять з даних генетичних досліджень, що обговорюються нижче, і недавно створених на тварин моделей. Однак деякі дані експериментів in vitro дозволяють припустити, що, незважаючи на те, що Ав - нормальний продукт метаболізму, сам по собі він нейротоксічен. Ця нейротоксичность регулюється фізичним станом АР, причому фібрилярний амілоїд більше нейротоксічен, ніж неагрегірованний розчинний АР (Pike et al, 1993- Simmons et al, 1994).
Таким чином, патологічний процес з хворобою Альцгеймера може прискорюватися не самим по собі Ав, а збіркою in vivo цього пептиду в фібрилярний амілоїд всередині Альцгеймера сенильних бляшок.
Ще одне ключове питання, який слід адресувати дослідникам амілоїду: який механізм нейротоксичної дії агрегованого Ар? Передбачалося пряма участь АР в генерації вільних радикалів (Behl et al, 1994- Hensley et al, 1994), зміни в нейрональної кальциевом гомеостазі (Mattson et al, 1992) або його побічна дія як вогнища генерації запальної відповіді (Rogers et al, 1992) . Яким би не був механізм пошкодження нейронів, індукований накопиченням Ав, нейрогистологічних процес при хворобі Альцгеймера включає нейрофібрилярних клубки. Тому в будь-який переконливою моделі БА можна простежити зв`язок між формуванням бляшок і утворенням клубків. Результати деяких досліджень дозволили припустити, що в нейронах, що живуть в культурі, препарати Ар частково індукують молекулярні зміни, виявлені в нейрофібріллярних клубках (Greenberg et al, 1994). Однак в інших дослідженнях була продемонстрована пряма фізична зв`язок між Ар і основними білковими компонентами клубків (Smith et al, 1995). Питання, індукує чи АР формування нейрофібрилярних клубків прямим, непрямим або навіть зворотним шляхом при певних обставинах, коли освіту клубків сприяє відкладенню амілоїду, повинен залишитися для суперечок і подальших досліджень.